Regulatie van motiliteit door het centrale paar
Motiliteitsveranderingen in antwoord op externe stimuli kunnen één van twee vormen aannemen. De stimulus kan de frequentie van willekeurige heroriëntatie veranderen, zoals bij bacteriën gebeurt, zodat motiliteit in een gunstige richting wordt beloond, of de stimulus kan de motiliteit rechtstreeks reguleren, zodat het organisme in een bepaalde richting ten opzichte van de stimulus draait (in de richting van de stimulus voor positieve taxis, weg voor negatieve taxis). Een dergelijke tactische draaiing vereist gelokaliseerde receptoren die als antenne kunnen fungeren, en een motiliteitsapparaat dat directioneel gecontroleerd kan worden (Foster en Smyth, 1980). Een eenvoudige stop-reorient-start type regeling vereist geen verfijnde regulatie van de motiliteit. Bij flagellen vereist richtingsturing gecoördineerde veranderingen in golfvorm en slagfrequentie en dus een meer gesofisticeerd reguleringsapparaat. Het centrale paar-radiale spaaksysteem vervult die rol in 9+2 cilia en flagella, zoals het elegantst is aangetoond in Chlamydomonas (Fig. 1D). Deze eencellige biflagellate alg reageert op fototactische stimuli door de relatieve golfvorm, slagsnelheid en slagfrequentie van zijn twee flagellen te veranderen (Witman, 1993). Beschikbare gegevens wijzen erop dat fototaxis een signaaltransductieweg impliceert van het centrale apparaat, via radiale spaken, naar een doublet-geassocieerd regulatorisch complex, dat vervolgens het patroon van dyneïne-activiteit wijzigt en daarmee van bochtvorming en -voortplanting door veranderingen in dyneïne-geassocieerde proteïnekinasen en -fosfatasen (Porter en Sale, 2000; Smith en Yang, 2004).
Hoewel er meer dan één mogelijke manier kan zijn geweest om een asymmetrisch centraal apparaat te vormen, kan een op een minimale steiger van twee microtubuli gebouwd apparaat de eerste zijn geweest om te evolueren en zou een minimale verandering van het protocilium vereisen, hoofdzakelijk de toevoeging van een nieuwe assemblage-initiatieplaats in de overgangszone samen met een structuur (radiale spaak) voor het overbrengen van signalen van het centrale apparaat naar dyneïnen die met het dubbele geassocieerd zijn. Wij stellen ons voor dat de radiale spaken geëvolueerd zijn uit de dyneïneregulatie in bladen van doubletten, waar zij aan hun basis interageerden met een doublet-geassocieerd dyneïneregelingscomplex en aan hun uiteinden met microtubule-geassocieerde proteïnen op een andere rij doubletten of op een corticaal singlet microtubule cytoskelet. Het lijkt opmerkelijk, gezien de waarschijnlijkheid dat flagellaire dyneïnen geëvolueerd zijn uit cytoplasmatische dyneïnen, dat er geen gemeenschappelijke regulatorische mechanismen bekend zijn voor deze twee dyneïne families. Dit kan echter eerder een gevolg zijn van ons huidig gebrek aan kennis dan van een afwezigheid van geconserveerde mechanismen. Recente moleculaire analyse van een eiwit in het Chlamydomonas dyneïne regulator complex onthulde een primaire structuur die wel overeenkomsten vertoont met cytoplasmatische eiwitten, maar een relatie met cytoplasmatische dyneïne is niet vastgesteld (Rupp en Porter, 2003).
Het uitzoeken van specifieke patronen van interactie tussen projecties van het centrale paar microtubuli en radiale spaken die specifieke veranderingen in dyneïne activiteit teweegbrengen blijft een groot raadsel. Recente resultaten van ons lab, waaronder de analyse van de normale structuur van het centrale paar, karakterisering van mutanten die het centrale paar niet kunnen assembleren, en bepaling van de oriëntatie van het centrale paar tijdens de voortplanting van de bocht, beperken de modellen van hoe de CP dyneïne reguleert. Hier proberen we een hypothese op te stellen van centrale paar regulatie die consistent is met deze resultaten.
Vorige dunne doorsnede elektronenmicroscopie van Chlamydomonas en Tetrahymena axonemes, samen met negatieve kleuring preparaten van centrale paar complexen van Tetrahymena cilia (Chasey, 1969) en rat sperma flagella (Olson en Linck, 1977) onthulden de asymmetrische structuur van centrale paar complexen en definieerden de CP microtubule met langere projecties in doorsnede en 32 nm herhalingsperiodiciteiten als C1, terwijl de andere (C2) kortere projecties heeft met slechts 16 nm herhalingen. Door vergelijking van transversale en longitudinale dunne doorsneden van wild type centrale paar complexen met centrale paar complexen van assemblage mutanten pf6 en cpc1, heb ik de structurele verwantschappen en herhaalperioden bepaald voor de meeste van de C1 en C2-geassocieerde projecties in Chlamydomonas. Aanzichten van het oppervlak die door stereobeelden van snel-bevroren, diepe etsvoorbereidingen worden verstrekt bevestigden en breidden die conclusies uit en resulteerden in een vrij volledige 3-d reconstructie van het centrale paar (Mitchell, 2003a). Deze studies geven een model van potentiële spaakinteractieplaatsen op het centrale paar, en tonen in het bijzonder discontinuïteiten in het verder cilindrische oppervlak van de CP langs de microtubulusoppervlakken die naar aangrenzende spaakkoppen zijn gericht. Ook de asymmetrie van het CP-complex wordt benadrukt, wat wijst op unieke spaakinteracties op verschillende radiale posities rond de CP-cilinder. Klonering van de pf6 (Rupp et al., 2001) en cpc1 (Mitchell and Sale, 1999; Zhang and Mitchell, 2004) genen en identificatie van hun genproducten leverden geen duidelijke kandidaten op voor eiwitten die interageren met radiale spaken, maar een kinesine-achtig eiwit (Klp1) op de C2 microtubule (Bernstein et al., 1994) is een aantrekkelijke kandidaat voor een spaak bindend eiwit. Wij hebben onlangs aangetoond dat flagellen in Klp1 knockdown cellen met dramatisch verminderde frequenties slaan (Mitchell en Yokoyama, 2003).
EM studies laten zien dat de CP een vaste oriëntatie ten opzichte van het cellichaam en de buitenste doubletten behoudt in sommige organismen, terwijl in andere de CP een variabele oriëntatie heeft. Fylogenetisch lijkt een vaste oriëntatie een afgeleide vereenvoudiging te zijn in organellen die een vast buigingsvlak hebben, zoals ctenophore kamplaat cilia (Tamm en Tamm, 1981) en veel metazoan spermatozoa (Sale, 1986). In extreme voorbeelden zijn de C1 en C2 microtubuli verbonden met respectievelijk doubletten 8 en 3 door permanente schakels (hetzij gemodificeerde spaken, hetzij hulpstructuren). Het tegenovergestelde uiterste wordt gevormd door cilia en flagellen van eencellige organismen, die afhankelijk zijn van snelle veranderingen in golfvorm, slagfrequentie en effectieve slagoriëntatie om te reageren op omgevingscues. De CP in deze organellen zijn gedraaid, zodat zij binnen de omringende 9 doubletten geen vaste oriëntatie van basis tot top behouden. Bovendien draaien deze gedraaide CP tijdens de voortplanting van de bocht (Omoto et al., 1999). Wij hebben onlangs aangetoond dat de CP van Chlamydomonas binnen elke bocht evenwijdig aan het bochtvlak is georiënteerd (fig. 1D) en 180° draait tussen opeenvolgende hoofd- en omgekeerde bochten, en dat de C1-microtubulus zich altijd het dichtst bij doubletten aan de buitenzijde van elke bocht bevindt (Mitchell, 2003b). Deze constante oriëntatie van de CP ten opzichte van een bocht in Chlamydomonas maakt het mogelijk dat één set CP-projecties interageert met radiale spaken op doubletten met actieve dyneïnen, terwijl een andere set CP-projecties interageert met radiale spaken op doubletten met inactieve dyneïnen.
Hoewel de beat envelope in Chlamydomonas vrijwel vlak is, en de richting van de hoofdbochten niet dramatisch verandert ten opzichte van een constant vlak, is dit niet het geval in andere organismen. Als de oriëntatie van de CP ook in deze andere organismen de richting van de bochten volgt, zoals ik voorstel, dan is de CP altijd zo gepositioneerd dat hij de motiliteit soepel kan regelen. Uit onze recente resultaten blijkt dat de oriëntatie van het CP zich passief voegt naar de kromming aan de basis van een flagellum van Chlamydomonas, en dat deze krommingsafhankelijke oriëntatie zich verplaatst naarmate de kromming zich voortplant van de basis naar de top. Een analogie uit de machinebouw is een wormwiel, waarbij de rotatie van de worm (het centrale paar) wordt bepaald door de loodrechte beweging (verbuiging) van de tandwielen van een getand tandwiel (axonemale krommingen). De richting van een hoofdbocht kan derhalve niet worden bepaald door de oriëntatie van het centrale paar, dat zich passief conformeert aan de bochten, maar moet worden geregeld op het niveau van het buitenste doublet, via initiatiepatronen aan de flagellaire basis. Regelgevende signalen van de CP kunnen dan vorm en slagfrequentie bepalen door directe modulatie van dyneïne activiteitspatronen binnen zich ontwikkelende en voortplantende bochten. Deze hypothese is in overeenstemming met de resultaten van vibrerende heroriëntatie van het slagvlak van axonemes van zee-egels (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Als het nieuwe door vibratie veroorzaakte slagvlak een nieuwe oriëntatie van het centrale paar afdwingt, dan zou ontspanning van het systeem na verwijdering van de opgelegde vibratie uit deze cellen een geleidelijke rotatie van het centrale paar terug naar de rustpositie vereisen. Helaas werd in deze experimenten geen informatie over de feitelijke CP-oriëntatie verkregen. Deze hypothese is ook consistent met het patroon van doublet glijden waargenomen in protease-behandelde Chlamydomonas axonemes, waarin doublet glijden patronen handhaven een constante relatie tot centrale paar oriëntatie (Wargo en Smith, 2003; Wargo et al., 2004), en met studies van dyneïne activiteit in verstoorde Chlamydomonas (Smith, 2002) en zee-egel (Yoshimura en Shingyoji, 1999; Nakano et al., 2003) axonemes, die calcium- en centrale paar-afhankelijke activiteit modulatie laten zien.
Van welke voorspellende waarde zijn deze speculaties over de evolutie van cilia en flagella? Ten eerste stellen we de hypothese dat de ontwikkeling van flagellaire oppervlakte motiliteit primitief is en waarschijnlijk op grote schaal wordt aangetroffen, zelfs in ciliaire derivaten die niet kloppen. Het is duidelijk dat IFT een essentiële en universele motiliteit is voor de assemblage van zowel motiele als niet-motiele organellen, dus de koppeling van deze machinerie aan extracellulaire beweging kan even wijdverbreid zijn. Ten tweede is het sekwestreren van receptoren op ciliaire membranen ook primitief, en waarschijnlijk een belangrijke selectieve druk voor het voortbestaan van niet-motiele primaire cilia, evenals meer sterk gemodificeerde cilia van zintuigelijke organen. Aangezien ciliaire derivaten essentiële functies vervullen in sensorische neuronen van veel organismen, is er slechts een kleine sprong in de verbeelding nodig om te suggereren dat het protocilium ook het voorouderlijke platform vormde voor alle sensorische processen, en dat aanvullende kenmerken van dit organel gemeenschappelijk kunnen zijn in sensorische transductie cascades. Ten derde is de oriëntatie van het centrosoom als indicator van celpolariteit en van de migratierichting voor beweeglijke cellen ook zeer primitief. Als dat zo is, suggereert het belang van het protocilium als een vroege determinant van celpolariteit en gerichte migratie dat er meer verbanden moeten worden gezocht tussen mechanismen die celpolariteit bepalen en mechanismen die centrosomen/centriolen oriënteren samen met de cytoplasmatische microtubule array. Tenslotte moet de regulatie van cilia en flagella door het centrale paar zich ook zeer vroeg in de eukaryote evolutie hebben ontwikkeld, vóór de radiatie van alle bestaande eukaryote fyla. Hoewel er ongetwijfeld verschillen bestaan in de gedetailleerde regulatie die door deze organellen in verschillende organismen en celtypen wordt vereist, moeten we verwachten veel universele eigenschappen te vinden in de manier waarop centraal paar-radiale spaak interacties dyneïne activiteit reguleren, en kunnen we nog gemeenschappelijke thema’s vinden in de regulatie van axonemale en cytoplasmatische dyneïne motoren.