PMC

Representatieve resultaten

Het vermogen van plaque-assays om nauwkeurig virale titers te beoordelen is afhankelijk van een groot aantal factoren: de juiste gastheer celselectie, juiste media en groeiomstandigheden voor cellulaire en virale levensvatbaarheid, geïmmobiliseerde virale vermeerdering, en een nauwkeurige bepaling van de virale incubatieperiode om voldoende tijd voor verschillende en telbare plaquevorming toe te staan.

Voor deze studie, virussen uit drie representatieve families werden gekozen om verschillen aan te tonen in: overlay selectie, incubatieperiode, en plaque morfologie over verschillende soorten monsters. Venezuelan Equine Encephalitis (VEEV) werd geselecteerd als een (+)ssRNA viraal model, dat aanzienlijke ziekte kan veroorzaken bij paarden en mensen en de Togaviridae familie vertegenwoordigt. Influenza B Taiwan stam, een gesegmenteerd (-)ssRNA virus dat voornamelijk mensen infecteert, vertegenwoordigt de Orthomyxoviridae familie. Rift Valley-koortsvirus (RVFV), een (-)ssRNA-virus dat voornamelijk geleedpotigen, herkauwers en mensen infecteert, werd geselecteerd als vertegenwoordiger van de Bunyaviridae-familie.

Voor RVFV (figuur 1), werden titers bepaald van een stockoplossing van een recombinant levende verzwakte MP12 stam van RVFV in een 12 wells plaatformaat met gebruikmaking van CMC, agarose, of Avicel overlays die naast elkaar werden geïncubeerd gedurende 72 uur na infectie (hpi). Een representatieve plaat met verdunningen van 10-4 tot 10-7 is te zien in Paneel A. Plaatjes met CMC- en agarose-overlagen vertoonden kleine, heldere en duidelijke plaques met een goed gedefinieerde cirkelvormige rand. Plaatjes met een vloeibare overlay waren iets talrijker en groter in vergelijking met agarose- en CMC-plaatjes, en vertoonden een minder duidelijke rand. Virale titers werden vergeleken in Panel B met alle overlays die vergelijkbaar presteerden.

Om een duidelijker visuele vergelijking tussen overlays voor MP12 te verkrijgen, samen met een grotere steekproefgrootte om de reproduceerbaarheid te bepalen, werd ook een 6 wells plaat in drievoud getest (figuur 2). In het 6 wells plaatformaat toonde het gebruik van een CMC-overlay kleinere plaques dan agarose- of vloeibare overlays, die in grootte vergelijkbaar waren met elkaar. Terwijl virale titers vergelijkbaar waren tussen alle drie de overlays (Paneel D), bleken plaques gevormd in agarose en vloeibare overlays gemakkelijker te tellen vanwege hun grotere omvang.

In tegenstelling tot RVFV, varieerden VEEV-titers en plaquemorfologie tussen de verschillende overlays aanzienlijk (figuur 3A). Plaques gevormd in CMC overlays toonden een duidelijke en onderscheiden morfologie bij gebruik van een 12 wells plaatformaat, ten koste van plaque grootte en gevoeligheid (Paneel B). In tegenstelling tot CMC resulteerde het gebruik van agarose en vloeibare overlays in aanzienlijk grotere plaques, wat wijst op een lagere virale inhibitie en een verhoogde gevoeligheid voor VEEV-replicatie. Dit werd eerder bevestigd toen uitsluitend agarose vergeleken werd met CMC in een artikel gepubliceerd door Juarez et al.4. Hoewel agarose en vloeistof overlays grotere plaques produceerden dan CMC, hadden de plaques slecht gedefinieerde randen en waren ze moeilijk te tellen in een 12 wells formaat, waarbij vloeistof overlays de grootste verspreiding van de randen gaven. Wanneer plaques werden getest in 6 wells platen (figuur 4), de grotere 6 wells formaat teniet gedaan de kwestie van duidelijk grote plaques die moeilijk te onderscheiden in de 12 wells formaat, met agarose en vloeistof overlays blijken superieur aan de CMC overlays in termen van plaque definitie en gevoelig (figuur 4D).

In vergelijking met RVFV of VEEV, influenza biedt een aantal unieke uitdagingen bij het plaqueren, zoals de eis van een externe protease. De gevoeligheid van influenzavirus verschillende overlay selecties is ook goed gedocumenteerd in het verleden als significante veranderingen zijn opgemerkt wanneer modificaties zo klein als verschillende merken agarose zijn gebruikt9.

Interessant voor de Influenza B Taiwan stam, het gebruik van CMC als een overlay resulteerde in duidelijk kleinere plaques die moeilijk te tellen waren en bleek moeilijk betrouwbaar te scoren (Figuur 5A). Het gebruik van een agarose overlay leverde de beste plaques (Paneel C), en resulteerde in een donkerder achtergrond vlek (waarschijnlijk als gevolg van verhoogde monolayer levensvatbaarheid), en toonde duidelijker en scherper plaques in directe vergelijking met het gebruik van de vloeibare overlay (Paneel B).

Een duidelijk voordeel van vloeibare polymeren boven vaste en halfvaste overlays, zoals agarose en CMC, ligt in het gemak van verwijdering en toepassing. Halfvaste deklagen moeten worden verwarmd, en verharding kan problematisch blijken bij het hanteren en verwijderen. Om te profiteren van deze voordelen en om de uitvoerbaarheid van het gebruik van Avicel in een high-throughput manier voor RVFV bepalen, werd een 96 wells plaat formaat getest op verschillende overlay concentraties (figuur 6). Voor RVFV MP-12, werden verdunningen uitgevoerd in viervoud op zowel 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel. Het aanbrengen en verwijderen van de overlay bleek eenvoudig, zonder duidelijke verschillen tussen de replicaten of tussen de concentraties, wat een hoge mate van reproduceerbaarheid aantoont. Bij het scoren, plaques waren duidelijk en telbaar met het blote oog, waaruit blijkt de haalbaarheid van het gebruik van vloeibare overlays in een hoge doorvoer manier voor RVFV.

Figuur 1: RVFV plaque overlay vergelijkingen met behulp van 12 wells platen. Veros werden uitgezet met 2,5 x 105 cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 µl met hetzelfde serieel verdunde uitgangsmonster van MP12. Na infectie werden 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC (eindconcentraties) aangebracht om de overlays rechtstreeks te vergelijken, zoals aangetoond in Paneel A. De plaques werden geteld en getiterd in Paneel B.

Figuur 2: RVFV plaque overlay vergelijkingen met behulp van 6 wells platen. Veros werden uitgezet met 5 x 105 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 µl met hetzelfde serieel verdunde uitgangsmonster van MP12. Drie ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC werden aangebracht om de overlays rechtstreeks te vergelijken, zoals aangetoond in Paneel A, B en C. Afzonderlijke experimenten werden op identieke wijze uitgevoerd als beschreven voor Panelen A-C, waarbij de plaques werden geteld en getiterd in Paneel D (N = 3).

Figuur 3: VEEV-plaque overlay-vergelijkingen met behulp van 12 wells platen. Veros werden uitgezet met 2,5 x 105 cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 µl met hetzelfde serieel verdunde uitgangsmonster van de VEEV TC-83-vaccinstam. Na infectie werden 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht om de overlays rechtstreeks te vergelijken, zoals aangetoond in Paneel A. De plaques werden geteld en getiterd in Paneel B.

Figuur 4: VEEV plaque overlay vergelijkingen met behulp van 6 wells platen. Veros werden uitgezet op 5 x 105 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 µl met hetzelfde serieel verdunde startmonster van VEEV TC-83. Na infectie werden 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel of 1% CMC aangebracht om de overlays rechtstreeks te vergelijken, zoals aangetoond in Panels A, B en C. Afzonderlijke experimenten werden op identieke wijze uitgevoerd als beschreven voor Panels A – C, waarbij de plaques werden geteld en getiterd in Paneel D (N = 3).

Figuur 5: Influenza plaque overlay vergelijkingen. MDCK-cellen werden uitgezet op 5 x 105 cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 µl inoculum met hetzelfde serieel verdunde uitgangsmonster van Influenza B Taiwan. In de groeimedia of overlays werd geen foetaal runderserum (FBS) gebruikt, aangezien FBS de voortplanting van Influenza kan remmen door remming van bepaalde proteasen die nodig zijn voor virale fusie. TPCK-trypsine werd aan alle overlays toegevoegd voordat ze werden aangebracht, om de virale fusie en het binnendringen in de gastheercellen te vergemakkelijken. Na infectie werden 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC aangebracht om de overlays direct te vergelijken zoals aangetoond in Paneel A , B en C. Afzonderlijke experimenten werden op identieke wijze uitgevoerd zoals beschreven in Panelen A – C, met plaques geteld en getiterd in Paneel D (N = 3). Hoewel een gemiddelde werd genomen voor CMC-plaques, bleken deze moeilijk betrouwbaar te tellen omdat ze diffuse randen vertoonden en zeer kleine plaques waren.

Figuur 6:High throughput plaque overlays. Een 96 wells plaat van Veros uitgezet met 3 x 104 cellen per well, werd geïnfecteerd met 50 µl inoculum met hetzelfde serieel verdunde startmonster van RVFV MP12 gedurende 1 uur, in viervoud. Voor de overlays werden 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel uitgeprobeerd om de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van het gebruik van vloeibare overlays op een high-throughput manier te bepalen, Panelen A en B.

Tabel 1:Plaque Assay Inoculatiecondities en celtypen

Tabel 2:Plaque and Viral/Cellular Growth Medias

Overlay-oplossingen vervallen niet wanneer zij zijn aangemaakt, zolang de steriliteit wordt gehandhaafd.

Tabel 3:Overlays Voorraad

Tabel 4: Plaatformaten