3.1 OMVs: Composition, Biogenesis, and Functional Roles
OMV’s zijn resistente en discrete bolvormige lipide tweelagige nanostructuren, variërend tussen 10 en 300 nm in diameter, afgeleid van de celenvelop en niet in staat om onafhankelijk te repliceren (Kulp en Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4). Onthechting van OMV’s werd meer dan 50 jaar geleden voor het eerst waargenomen in transmissie-elektronenmicrofoto’s waarop de ultrastructuur van de bacteriële celwand werd afgebeeld (Bladen en Waters, 1963; Bayer en Anderson, 1965; Chatterjee en Das, 1967). Er werd vastgesteld dat deze nanosferische structuren bestonden uit een enkel membraan rond een elektronendicht centrum (Work et al., 1966). Andere studies uit dezelfde periode meldden ook de aanwezigheid van “extracellulaire bolletjes” in het celvrije supernatant van E. coli gekweekt onder voedingsstofbeperkende groeiomstandigheden (Bishop and Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Daarom werd aanvankelijk verondersteld dat de vorming van OMV’s uitsluitend onder stressvolle omstandigheden plaatsvond. Nader onderzoek toonde echter duidelijk aan dat OMV’s ook onder niet-stressvolle omstandigheden kunnen worden gedetecteerd, zowel in laboratorium- als omgevingsomstandigheden (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Tegenwoordig is bekend dat OMV’s bijdragen aan een groot aantal belangrijke biologische functies, en een van de eerste rollen die ooit voor OMV’s werden beschreven, is hun betrokkenheid bij pathogenese, met name als overbrengers van virulentiefactoren (besproken in Ellis en Kuehn, 2010). In de loop der jaren zijn, afhankelijk van de soort en de kweekomstandigheden, aanvullende functies aan OMV’s toegeschreven, waaronder intra-/interspeciescommunicatie, respons op omhullingsstress, nutriëntenverwerving, horizontale genoverdracht, optreden als “lokstof” en als collectieve goederen (voor een gedetailleerde beschrijving, zie Kulp en Kuehn, 2010 en Schwechheimer en Kuehn, 2015). In het algemeen lijken OMV’s de overleving van de bacterie binnen een specifieke omgevingsniche te bevorderen, wat hun relevantie voor bacteriële homeostase benadrukt.
Fig. 4. Buitenste membraanblaasjes van Gram-negatieve bacteriën. (A) Voorstelling van een buitenmembraandeeltje (OMV-bovenste paneel) afkomstig van de bacteriële celwand (onderste paneel). Details van het buitenmembraan (OM) en binnenmembraan (IM) worden getoond, inclusief transmembraaneiwitten. De periplasmatische ruimte, waarin zich de peptidoglycaanlaag (PG) bevindt, toont oplosbare periplasmatische eiwitten, verkeerd gevouwen eiwitten, en nucleïnezuren. De inhoud van de OMV illustreert een deel van de biomoleculen die zowel op hun membraan als op hun lumen werden geïdentificeerd. (B en C) Transmissie-elektronenmicrofoto’s van met uranylacetaat negatief gekleurde Synechocystis sp. PCC 6803 cel die een OMV vrijgeeft (B, 120.000 × vergroting), en celvrij geconcentreerd extracellulair medium van Synechocystis sp. PCC 6803 dat verschillende OMV’s toont (C, 40.000 × vergroting).
(A)Gebaseerd op Jan, A.T., 2017. Outer membrane vesicles (OMVs) of Gram-negative bacteria: a perspective update. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numerieke studies hebben aangetoond dat OMV’s verrijkt zijn met OM-componenten, namelijk LPS en OMP’s, evenals periplasmatische eiwitten, PG-fragmenten, en zelfs cytoplasmatische en nucleïnezuren (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). Vroege rapporten maakten eigenlijk geen onderscheid tussen kunstmatig in oplossing gevormde MV’s (als gevolg van het natuurlijke lipidengedrag van hergroepering in vesikels, waarbij materiaal van bacteriële lysis lukraak wordt ingesloten) en intacte OMV’s. Meer recentelijk hebben verbeterde isolatiemethodologieën en de modernste omicatechnieken een zorgvuldige analyse van de samenstelling van OMV’s mogelijk gemaakt. Opmerkelijk is dat OMV’s in feite verrijkt zijn met specifieke cellulaire componenten, terwijl ze verarmd zijn in andere (Lee et al., 2008), wat het idee ondersteunt dat de selectie van de ladinginhoud geen willekeurig proces is. Zo varieerde de inhoud van OMV’s van Salmonella sp. naar gelang van de geteste groeiomstandigheden: in OMV’s geïsoleerd uit cellen onder nutriëntrijke omstandigheden werden bij voorkeur cytosolische eiwitten gedetecteerd die betrokken zijn bij translatie en cellulair metabolisme, terwijl OMV’s onder beperkende voedingsomstandigheden verrijkt waren in membraaneiwitten die betrokken zijn bij nutriëntentransport (Bai et al., 2014). Bovendien gaf een op massaspectrometrie gebaseerde aanpak aan dat er geen breed geconserveerde specifieke component werd gedetecteerd in OMV’s (Schwechheimer et al., 2013), wat opnieuw wijst in de richting van een variabele samenstelling. Al met al wordt verwacht dat differentiële OMVs-samenstellingen zowel gerelateerd zijn aan stam-afhankelijke celomhullende bijzonderheden als aan verschillende ecologische niches (Yoon, 2016).
Drie elkaar niet uitsluitende OMVs vormingsmechanismen zijn voorgesteld. In één model treedt vesiculatie op wanneer covalente cross-links tussen membraaneiwitten en de PG-laag lokaal worden verbroken, hetzij door een tijdelijke afname van de algehele abundantie van cross-links of door een gelokaliseerde verplaatsing van cross-links, waardoor de uitstulping van kleine OM-porties wordt bevorderd. Een ander model gaat uit van periplasmatische nanoterritoria waarin verkeerd gevouwen eiwitten en andere omhullende componenten (LPS of PG-fragmenten) zich ophopen. Als gevolg van deze abnormale, opeenhoping van cellulaire componenten neemt de integriteit van het omhulsel plaatselijk af, wat leidt tot het leeglopen van OM-gedeelten die geladen zijn met lumenaire inhoud. Tenslotte is ook voorgesteld dat bepaalde biofysische eigenschappen van bepaalde OM-lipiden vesiculatie kunnen bevorderen door de specifieke integratie van LPS of fosfolipiden te lokaliseren, wat leidt tot veranderingen in membraanfluïditeit en -flexibiliteit. Er wordt ook aangenomen dat veel andere factoren van invloed zijn op de grootte, productiesnelheid en samenstelling van OMV’s, en als er een consensus OMV’s biogeneseproces bestaat, is het niet volledig gekarakteriseerd (Kulp en Kuehn, 2010; Schwechheimer en Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
In cyanobacterieel onderzoek is het gebied van OMV’s nog vrij recent, en er moet nog veel worden verkend. Dit wordt bijzonder goed geïllustreerd door het feit dat de vroegste publicatie die exclusief gewijd is aan de studie van cyanobacteriële OMV’s dateert uit 2014 (Biller et al., 2014). In deze baanbrekende studie wordt niet alleen aangetoond dat laboratoriumgecontroleerde culturen van de mariene cyanobacterie Prochlorococcus continu OMV’s vrijgeven, maar ook dat deze blaasjes overvloedig kunnen worden aangetroffen in zeewatermonsters. Bovendien werd aangetoond dat Prochlorococcus OMVs in staat waren de groei van heterotrofe bacterieculturen te ondersteunen, waardoor deze structuren een rol spelen in de mariene koolstoffluxen. Bovendien werden mariene faag-veicle interacties waargenomen, wat het potentieel van OMV’s aantoont om te fungeren als “decoy” agenten. In het algemeen illustreerden de auteurs enkele van de fundamentele rollen van OMV’s en hun ontelbare implicaties voor microbiële ecosystemen (Biller et al., 2014). In een recentere publicatie werden OMV’s van Prochlorococcus vergeleken met die van drie andere mariene heterotrofen, in een poging om de frequentie van DNA-verpakking in blaasjes en variatie tussen verschillende taxa te ontsluieren (Biller et al., 2017). Door de hoeveelheid en distributie van DNA geassocieerd met OMV’s te onderzoeken, werd aangetoond dat DNA differentieel wordt ingekapseld binnen en tussen OMV’s populaties. Doorslaggevender is dat dit werk suggereert dat het mechanisme dat DNA in OMV’s verpakt, niet bij alle bacteriën even sterk werkt (Biller et al., 2017). Naast Prochlorococcus en de mariene Synechococcus-stammen is ook aangetoond dat andere cyanobacteriën OMV’s vormen en vrijgeven, waaronder de eencellige Synechococcus sp. PCC 7002 (Xu et al., 2013) en Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), de filamenteuze Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al, 2017), en de filamenteuze, heterocyst-vormende Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) en Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Naast de hierboven beschreven rollen voor mariene cyanobacteriën-afgeleide OMV’s (Biller et al., 2014), zijn er andere functies voorgesteld voor deze extracellulaire blaasjes. Het vrijkomen van OMV’s door cyanobacteriën zou kunnen werken als een effectieve secretieroute. Een metabolisch gemanipuleerde Synechococcus sp. PCC 7002 stam die twee glycogeensynthase genen, glgA-I en glgA-II, mist, bleek significant meer OMV’s vrij te geven dan de wild-type stam (Xu et al., 2013). De auteurs veronderstelden dat, aangezien deze mutant spontaan oplosbare suikers naar het medium exporteerde, de waargenomen OMV’s in verband konden worden gebracht met dit secretiemechanisme, hoewel het suikergehalte van de waargenomen OMV’s niet werd geëvalueerd (Xu et al., 2013). Bovendien werd ook aangetoond dat een Synechocystis sp. PCC 6803-stam die de TolC-homoloog (essentieel voor membraanafhankelijke secretiemechanismen; zie Fig. 1 en 3) mist, significant meer OMV’s vrijgeeft dan de ouderstam (Oliveira et al., 2016). Aangezien de tolC-knockout sterk verstoord was in de secretie van intracellulaire eiwitten, metabolieten en exogene verbindingen, werd voorgesteld dat hypervesiculatie in de behoefte aan secretie kon voorzien. In overeenstemming hiermee is ook gesuggereerd dat cyanobacteriële OMV’s materiaal transporteren dat nodig is voor de ontwikkeling van een biofilm. Dit werd voorgesteld na observatie van cyanobiont-afgeleide blaasjes in het sporocarp van de watervaren Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Aangezien naar verluidt genetisch materiaal in deze blaasjes werd waargenomen, zouden deze blaasjes vectoren kunnen zijn voor laterale genoverdracht tussen de cyanobiont en de varen (Zheng et al., 2009). Cyanobacteriële OMV’s kunnen echter ook werken als een mechanisme om stress op het omhulsel af te voeren: Gonçalves et al. karakteriseerden een set van Synechocystis sp. PCC 6803 stammen die verschillende IM translocase componenten missen die betrokken zijn bij TolC-afhankelijke secretiesystemen (Gonçalves et al., 2018). Interessant is dat onder de verschillende stammen die verschillende capaciteiten van OMV-afgifte vertoonden, de tolC-knockout (de hoogste OMV-producent in de studie) de enige was die opmerkelijk hoge transcriptniveaus van spy en degQ vertoonde, coderend voor eiwitten die betrokken zijn bij stressreacties op de omhullende, en overexpressie van Spy en DegP (Gonçalves et al., 2018). Aldus suggereerden de auteurs dat deletie van tolC envelope stress uitlokt, en dat hypervesiculatie in de tolC-knockout een onafhankelijk mechanisme vertegenwoordigt om met dergelijke stressvolle omstandigheden om te gaan (Gonçalves et al., 2018).