Een algemene blottingprocedure begint met de extractie van totaal RNA uit een gehomogeniseerd weefselmonster of uit cellen. Eukaryotisch mRNA kan vervolgens worden geïsoleerd met behulp van oligo (dT) cellulosechromatografie om alleen die RNA’s met een poly(A)-staart te isoleren. De RNA-monsters worden vervolgens gescheiden door gelelektroforese. Aangezien de gels breekbaar zijn en de probes niet in de matrix kunnen doordringen, worden de RNA-monsters, nu gescheiden naar grootte, overgebracht op een nylon membraan via een capillair of vacuüm blotting systeem.
Capillair blotting-systeemopstelling voor de overdracht van RNA van een elektroforesegel op een blotting-membraan.
Een nylon membraan met een positieve lading is het meest effectief voor gebruik bij northern blotting, aangezien de negatief geladen nucleïnezuren er een hoge affiniteit voor hebben. De transferbuffer die voor de blotting wordt gebruikt, bevat gewoonlijk formamide omdat dit de annealingtemperatuur van de probe-RNA-interactie verlaagt, zodat geen hoge temperaturen nodig zijn, die tot RNA-degradatie kunnen leiden. Zodra het RNA op het membraan is overgebracht, wordt het door covalente binding aan het membraan geïmmobiliseerd met UV-licht of warmte. Nadat een probe van een label is voorzien, wordt deze aan het RNA op het membraan gehybridiseerd. Experimentele omstandigheden die de efficiëntie en specificiteit van hybridisatie kunnen beïnvloeden zijn onder andere ionensterkte, viscositeit, duplexlengte, verkeerd gematchte basenparen en basensamenstelling. Het membraan wordt gewassen om ervoor te zorgen dat de probe zich specifiek heeft gebonden en om het ontstaan van achtergrondsignalen te voorkomen. De hybride signalen worden vervolgens gedetecteerd met röntgenfilm en kunnen worden gekwantificeerd met densitometrie. Om controles te creëren voor vergelijking in een noordelijke blot, kunnen monsters die het genproduct van belang niet vertonen, worden gebruikt na bepaling door microarrays of RT-PCR.
GelsEdit
RNA lopen op een formaldehyde agarose gel om de 28S (bovenste band) en 18S (onderste band) ribosomale subeenheden te markeren.
De RNA-monsters worden meestal gescheiden op agarosegels met formaldehyde als denatureringsmiddel voor het RNA om de secundaire structuur te beperken. De gels kunnen worden gekleurd met ethidiumbromide (EtBr) en onder UV-licht worden bekeken om de kwaliteit en kwantiteit van het RNA te observeren alvorens te blotten. Polyacrylamide gelelektroforese met ureum kan ook worden gebruikt voor RNA-scheiding, maar wordt het meest gebruikt voor gefragmenteerd RNA of microRNA’s. Een RNA-ladder wordt vaak uitgevoerd naast de monsters op een elektroforesegel om de grootte van de verkregen fragmenten te observeren, maar in totaal RNA-monsters kunnen de ribosomale subeenheden fungeren als grootte-markers. Aangezien de grote ribosomale subeenheid 28S is (ongeveer 5kb) en de kleine ribosomale subeenheid 18S (ongeveer 2kb), verschijnen op de gel twee opvallende banden, waarvan de grootste bijna twee keer zo intens is als de kleinste.
ProbesEdit
Probes voor northern blotting bestaan uit nucleïnezuren met een complementaire sequentie voor alle of een deel van het RNA van belang, zij kunnen DNA, RNA, of oligonucleotiden met een minimum van 25 complementaire basen aan de doelsequentie zijn. RNA-sondes (riboprobes) die in vitro getranscribeerd zijn, zijn bestand tegen strengere wasstappen waardoor een deel van de achtergrondruis wordt voorkomen. Gewoonlijk wordt cDNA gemaakt met gelabelde primers voor de RNA-sequentie van belang om als probe in de northern blot te fungeren. De probes moeten worden geëtiketteerd met radioactieve isotopen (32P) of met chemiluminescentie, waarbij alkalische fosfatase of mierikswortelperoxidase (HRP) chemiluminescente substraten afbreken en een detecteerbare lichtemissie produceren. De chemiluminescente labeling kan op twee manieren plaatsvinden: ofwel wordt de probe aan het enzym gehecht, ofwel wordt de probe gelabeld met een ligand (bv. biotine) waarbij het ligand (bv. avidine of streptavidine) aan het enzym (bv. HRP) wordt gehecht. Röntgenfilm kan zowel de radioactieve als de chemiluminescente signalen detecteren en veel onderzoekers geven de voorkeur aan de chemiluminescente signalen omdat deze sneller en gevoeliger zijn en minder risico’s inhouden voor de gezondheid dan radioactieve labels. Hetzelfde membraan kan tot vijf keer worden gesondeerd zonder een significant verlies van het doel-RNA.