Hoe werkt ionenwisselingschromatografie?

Ion exchange (IEX) chromatografie is een techniek die vaak wordt gebruikt bij de zuivering van biomoleculen. Het gaat om de scheiding van moleculen op basis van hun lading.

Deze techniek maakt gebruik van de interactie tussen geladen moleculen in een monster en tegengesteld geladen samenstellingen in de stationaire fase van de chromatografiematrix. Dit type scheiding is moeilijk met andere technieken, omdat de lading gemakkelijk wordt gemanipuleerd door de pH van de gebruikte buffer.

Twee typen ionenuitwisselingsscheiding zijn mogelijk – kationenuitwisseling en anionenuitwisseling. Bij anionenwisseling is de stationaire fase positief geladen, terwijl die bij kationenwisseling negatief geladen is.

Principe van ionenwisselingschromatografie

IEX-chromatografie wordt gebruikt bij de scheiding van geladen biomoleculen. Het ruwe monster dat geladen moleculen bevat, wordt gebruikt als de vloeistoffase. Bij het passeren van de chromatografische kolom binden de moleculen zich aan tegengesteld geladen plaatsen in de stationaire fase.

De op basis van hun lading gescheiden moleculen worden geëlueerd met een oplossing van variërende ionische sterkte. Door een dergelijke oplossing door de kolom te laten lopen, vindt een zeer selectieve scheiding van moleculen op basis van hun verschillende ladingen plaats.

De techniek

De belangrijkste stappen in de ionenwisselingschromatografieprocedure worden hieronder opgesomd:

• Een onzuiver eiwitmonster wordt bij een bepaalde pH-waarde in de ionenwisselingschromatografiekolom geladen.
• Geladen eiwitten zullen zich binden aan de tegengesteld geladen functionele groepen in de hars
• Elutie van de gescheiden eiwitten vindt plaats met behulp van een zoutgradiënt. Bij lage zoutconcentraties worden eiwitten met weinig geladen groepen geëlueerd en bij hogere zoutconcentraties worden eiwitten met veel geladen groepen geëlueerd.
• Ongewenste eiwitten en onzuiverheden worden verwijderd door de kolom te wassen.

Een pH-gradiënt kan ook worden toegepast om afzonderlijke eiwitten te elueren op basis van hun isoëlektrisch punt (pI), d.w.z. het punt waarop de aminozuren in een eiwit neutraal geladen zijn en dus niet migreren in een elektrisch veld. Aangezien aminozuren zwitter-ionische verbindingen zijn, bevatten zij groepen met zowel positieve als negatieve ladingen. Afhankelijk van de pH van de omgeving hebben proteïnen een positieve, negatieve of nul lading. Bij hun isoëlektrisch punt is er geen interactie tussen de proteïnen en de geladen verbindingen in de harskolom, zodat zij worden geëlueerd. Een afnemende pH-gradiënt kan worden gebruikt om eiwitten te elueren met een anionenwisselingshars en een toenemende pH-gradiënt kan worden gebruikt om eiwitten te elueren met kationenwisselingsharsen. Dit komt doordat een verhoging van de pH-buffer van de mobiele fase tot gevolg heeft dat het eiwit minder geprotoneerd (minder positief geladen) wordt, zodat het geen ionische interactie met de negatief geladen hars kan vormen, waardoor elutie mogelijk wordt. Omgekeerd zal het verlagen van de pH van de mobiele fase ertoe leiden dat het molecuul meer geprotoneerd (minder negatief geladen_, waardoor zijn elutie.

Resin Selection in Ion Exchange Chromatography

Ion exchange harsen hebben positief of negatief geladen functionele groepen covalent gekoppeld aan een vaste matrix. De matrices zijn gewoonlijk gemaakt van cellulose, polystyreen, agarose, en polyacrylamide. Enkele factoren die van invloed zijn op de keuze van de hars zijn anion- of kationenwisselaar, stroomsnelheid, zwakke of sterke ionenwisselaar, deeltjesgrootte van de hars, en bindingscapaciteit. De stabiliteit van het eiwit van belang dicteert de keuze van een anion of een kation wisselaar – beide wisselaars kunnen worden gebruikt als de stabiliteit is van geen zorg.

De toepassingen van ionenwisseling chromatografie

Ion exchange is de meest gebruikte chromatografische methode voor de scheiding en zuivering van geladen biomoleculen zoals polypeptiden, eiwitten, polynucleotiden, en nucleïnezuren. De wijdverbreide toepasbaarheid, de hoge capaciteit en eenvoud, en de hoge resolutie zijn de voornaamste redenen voor het succes als scheidingsmethode. Ionenwisselingschromatografie wordt op grote schaal gebruikt in verschillende industriële toepassingen, waarvan sommige zijn als volgt:

• Scheiding en zuivering van bloedbestanddelen zoals albumine, recombinante groeifactoren en enzymen.
• Biotechnologie – Analytische toepassingen zoals kwaliteitscontrole en procesbewaking
• Voedselonderzoek en klinisch onderzoek – Voor het bestuderen van tarwevariëteiten en de correlatie van proteïnurie met verschillende nierziekten.
• Fermentatie – Kationenuitwisselingsharsen worden gebruikt voor het bewaken van het fermentatieproces tijdens de productie van ß-galactosidase.

Verder Lezen

• Alle Chromatografie Inhoud
• Chromatografie Overzicht
• Gas Chromatografie-Massa Spectrometrie (GC-MS) Toepassingen
• High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
• Liquid Chromatography-Massaspectrometrie (LC-MS) Toepassingen