Het sterke genoom van de kamferboom vult gaten in het begrip van de evolutie van het genoom van de bloeiende plant

De assemblage en annotatie van C. kanehirae

SCT is diploïd (2n = 24; supplementaire Fig. 1a) met een geschatte genoomgrootte van 823,7 ± 58,2 Mb/1 C (supplementaire Figs. 1b en 2). We produceerden een assemblage uitsluitend afgeleid van 85× PacBio long reads (read N50 = 11.1 kb; contig N50 = 0.9 Mb) die 728.3 Mb omspannen. De consensus sequenties van de assemblage werden gecorrigeerd met behulp van 141 × Illumina leest en verder gecodeerd met 207 × ‘Chicago’ gereconstrueerd chromatine en 204 × Hi-C gepaarde-end leest met behulp van de HiRise pijplijn (Supplementary Fig. 3). Een definitieve, geïntegreerde assemblage van 730.7 Mb werd geproduceerd in 2.153 scaffolds, die 91,3% van de flowcytometrie genoom grootte schatting. De uiteindelijke scaffold N50 was 50,4 Mb met meer dan 90% in 12 pseudomoleculen (Supplementary Table 1), vermoedelijk overeenkomend met de 12 SCT chromosomen.

Gebruik makend van een combinatie van referentie plant eiwit homologie ondersteuning en transcriptoom sequencing afgeleid van verschillende weefsels (Supplementary Fig. 1c en Tabel 2) en ab initio gen voorspelling, werden 27.899 eiwit-coderende gen modellen geannoteerd met behulp van de MAKER2 pijplijn18 (Supplementary Table 1). Van deze, 93,7% bleken homoloog met eiwitten in de TrEMBL database en 50% kan worden toegewezen Gene Ontology termen met behulp van eggNOG-mapper19. Het proteoom werd geschat op ten minste 89% compleet op basis van BUSCO20 (benchmarking universal single-copy orthologs) beoordeling, die vergelijkbaar is met andere gesequenced plantensoorten (Supplementary Table 1). Orthofinder21 clustering van SCT-genmodellen met die uit 12 verschillende genomen van zaadplanten leverde 20.658 orthologe groepen op (supplementaire tabel 3). 24.148 SCT-genen (86,56%) maakten deel uit van orthologe groepen met orthologen van ten minste één andere plantensoort. 3.744 genen waren niet ortholoog aan anderen, en slechts 210 genen maakten deel uit van de 48 SCT-specifieke orthologe groepen. Alles bij elkaar suggereren zij dat de fenotypische diversificatie bij magnoliiden mogelijk wordt gevoed door de novo geboorte van soortspecifieke genen en uitbreiding van bestaande genfamilies.

Genoomkarakterisering

Wij identificeerden 3.950.027 biallelische heterozygote plaatsen in het SCT-genoom, overeenkomend met een gemiddelde heterozygositeit van 0,54% (één heterozygoot single nucleotide polymorfisme (SNP) per 185 bp). De alternatieve (niet-referentie) allelfrequenties op deze plaatsen hadden een belangrijke piek rond 50%, consistent met het feit dat SCT diploïd is zonder aanwijzingen voor recente aneuploïdie (supplementaire Fig. 4). De ruimtelijke verdeling van heterozygote sites was zeer variabel, met 23,9% van het genoom met minder dan 1 SNP-locus per kb, vergeleken met 10% van het genoom met ten minste 12,6 SNP-loci per kb. Runs van homozygositeit regio’s bleek willekeurig te worden verdeeld over de SCT chromosomen, met een maximum van 20,2 Mb in schavot 11 (Fig. 1a). Dergelijke lange runs van homozygositeit regio’s hebben een gelijke sequentie dekking dan de rest van het genoom (Supplementary Fig. 5) en kan worden geassocieerd met selectieve sweeps, inteelt of recente knelpunten in de populatie. Genen in deze homozygositeitsregio’s bleken verrijkt te zijn in het biosyntheseproces van lignine en het galactosemetabolisme (supplementaire tabel 4), wat wijst op een mogelijke rol bij de vorming van lignine-carbohydraatcomplexen22. Paarsgewijze sequentiële Markoviaanse coalescentie23 (PSMC) analyse op basis van heterozygote SNP-dichtheden impliceerde een voortdurende vermindering van de effectieve populatiegrootte gedurende de afgelopen 9 miljoen jaar (Fig. 1b), met een mogelijke bottleneck samenvallend met de mid-Pleistocene klimatologische verschuiving 0,9 miljoen jaar geleden (Ma). Dergelijke patronen kunnen een complexe bevolkingsgeschiedenis van SCT weerspiegelen die samenhangt met de geologische geschiedenis van Taiwan, waaronder de opheffing en vorming van het eiland in het late Mioceen (9 Ma), gevolgd door de opbouw van bergen op respectievelijk 5-6 Ma24.

Transposable elementen en afgewisselde herhalingen maakten 48% uit van de genoomassemblage (aanvullende tabel 5). Het merendeel van de transponeerbare elementen behoorde tot lange terminale herhalingen (LTR) retrotransposons (25,53%), gevolgd door DNA transponeerbare elementen (12,67%). Van de LTR’s behoorden 40,75% en 23,88% retrotransposons tot respectievelijk Ty3/Gypsy en Ty1/Copia (supplementaire tabel 5). Fylogenie van het reverse transcriptase domein toonde aan dat de meerderheid van Ty3/Gypsy kopieën een aparte clade vormden (20.092 kopieën), vermoedelijk als gevolg van recente expansie en proliferatie, terwijl Ty1/Copia elementen gegroepeerd waren in twee zusterclades (7.229 en 2.950 kopieën) (supplementaire Fig. 6). Met uitzondering van twee scaffolds, waren zowel Ty3/Gypsy als Ty1/Copia LTR transposable elementen geclusterd binnen de pericentromerische centra van de 12 grootste scaffolds (Fig. 1c en aanvullende Fig. 7). Bovendien hadden de LTR-verrijkte regio’s (gedefinieerd door 100 kb met een overschot van 50% bestaande uit LTR klasse transponeerbare elementen) gemiddeld 35% meer dekking dan de rest van het genoom (Fig. 1c en supplementaire Fig. 8), wat suggereert dat deze herhalingen in de assemblage werden samengevouwen en kunnen hebben bijgedragen tot de verschillen in flow cytometrie en k-mer genoom grootte schattingen. De coderende sequentie-inhoud van SCT is vergelijkbaar met de andere angiospermische genomen die in onze analyses zijn opgenomen (aanvullende tabel 1), terwijl introns iets langer zijn in SCT als gevolg van een hogere dichtheid van transposable elementen (P < 0,001, Wilcoxon rank-sum test; aanvullende Fig. 9).

Zoals is beschreven voor andere planten genomen25, de chromosoom-niveau steigers van SCT vertonen een lage eiwit-coderende gen dichtheid en een hoge transponeerbare element dichtheid in de centra van chromosomen, en een verhoogde gen dichtheid naar de chromosoom uiteinden (Fig. 1c). We identificeerden clusters van een putatieve subtelomeer heptamer, TTTAGGG, die zich uitstrekt zo lang als 2.547 kopieën, die telomere herhalingen impliceren in planten 26 (Supplementary Tabel 6). Bovendien werden 687 kb van nucleair plastide DNA-achtige sequenties (NUPTs), met een gemiddelde van ongeveer 202,8 bp, blootgelegd (Supplementaire Tabel 7). SCT NUPTs werden overweldigend gedomineerd door korte fragmenten, met 96% van de geïdentificeerde NUPTs minder dan 500 bp (Supplementary Table 8). De langste NUPT is ~20 kb lang en syntenisch met 99,7% identiteit met een deel van het SCT plastoom dat zeven eiwit-coderende en vijf tRNA genen bevat (Supplementary Fig. 10).

Phylogenomische plaatsing van C. kanehirae zuster van eudicots

Om het langdurige debat over de fylogenetische plaatsing van magnoliiden ten opzichte van andere belangrijke bloeiende plantensoorten op te lossen, hebben we een fylogenetische boom geconstrueerd op basis van 211 strikt enkelvoudige kopieën van orthologe sets (dat wil zeggen, één en slechts één homoloog in alle soorten), geïdentificeerd via OrthoFinder21 genfamilieomschrijvingen van alle genmodellen uit de SCT en 12 andere zaadplanten-genomen (zie Methoden). Een enkele soortenboom werd verkregen door maximale waarschijnlijkheidsanalyse27 van een aaneengeschakelde supermatrix van de single-copy genuitlijningen en analyse op basis van coalescentie met behulp van de 211 genbomen28 (Fig. 2 en aanvullende Fig. 11). SCT, die de magnoliide lineage vertegenwoordigt, werd als zuster van de eudicot clade geplaatst (Fig. 2). Deze topologie bleef robuust toen we een transcriptoom dataset opnamen van nog eens 22 soorten magnoliiden uit het 1.000 planten initiatief29 (1KP), hoewel lagere bootstrap ondersteuning werd verkregen (Aanvullende Fig. 12). Met behulp van MCMCtree30 met fossiele ijkingen berekenden we een 95% betrouwbaarheidsinterval voor het tijdstip van divergentie tussen magnoliiden en eudicots van 136,0-209,4 Ma (Fig. 2), wat overlapt met twee andere recente schattingen (114,8-164,1 Ma31 en 118,9-149,9 Ma32).

Syntenie-analyse/gehele-genoom-duplicatie

Vorige onderzoeken van expressed sequence tags-gegevens leidden tot een genoomwijde duplicatie binnen de magnoliiden vóór de divergentie van de Magnoliales en Laurales10, maar een op syntenie gebaseerde toetsing van deze hypothese is niet mogelijk geweest zonder een geassembleerd magnoliide-genoom. In totaal werden 16.498 genparen geïdentificeerd in 992 syntenische blokken die 72,7% van het SCT genoom omvatten. Van deze intragenomische syntenische blokken bleek 72,3% syntenisch te zijn met meer dan één locatie op het genoom, wat suggereert dat meer dan één volledige genoom duplicatie (WGD) heeft plaatsgevonden in de voorouder van SCT (Fig. 3a). Twee ronden van oude WGD werden geïmpliceerd door uitgebreide syntenie tussen paren van chromosomale regio’s en significante maar minder syntenische koppeling van elke regio met twee extra genomische segmenten (Supplementary Fig. 13). Synteny blokken van SCT’s 12 grootste scaffolds werden toegewezen aan vijf clusters die kunnen overeenkomen met pre-WGD voorouderlijke chromosomen (Fig. 3a, aanvullende Fig. 13 en aanvullende noot).

Amborella trichopoda is de enige soort die de zusterlijn vertegenwoordigt van alle andere extante angiospermen en het heeft geen bewijs van WGD sinds de divergentie van de laatste gemeenschappelijke voorouder extante bloeiende plant lineages33. Om te bevestigen dat twee rondes van WGD plaatsvonden in de voorouders van SCT na divergentie van de lineages die leidden tot SCT en A. trichopoda, beoordeelden we de syntenie tussen de twee genomen. In overeenstemming met onze hypothese werden een tot vier segmenten van het SCT genoom uitgelijnd met een enkele regio in het A. trichopoda genoom (Fig. 3b en supplementaire Fig. 14).

Om de timing van de twee rondes van WGD die in het SCT genoom duidelijk zijn, nauwkeuriger af te leiden, werden intragenomische en interspecies homologe Ks (synonieme substituties per synonieme site) distributies geschat. SCT intragenomische duplicaten vertoonden twee pieken rond 0,46 en 0,76 (Fig. 4a), congruent met de twee WGD gebeurtenissen. Op basis van deze twee pieken konden wij de evolutie van het karyotype afleiden door de geclusterde syntenieblokken verder te ordenen in vier groepen die vermoedelijk afkomstig zijn van een van de vijf pre-WGD chromosomen (supplementaire Fig. 15). Vergelijking tussen Aquilegia coerulea (Ranunculales, een zusterlijn van alle andere overblijvende eudicots33) en SCT orthologen onthulde een prominente piek rond Ks = 1,41 (Fig. 4a), terwijl het Aquilegia intragenomische duplicaat rond Ks = 1 lag, wat duidt op onafhankelijke WGDs na de divergentie van de lijngroepen die tot SCT en Aquilegia hebben geleid. De beschikbaarheid van het transcriptoom van 17 Laurales + Magnoliales uit het 1KP29 stelde ons in staat de veronderstelde timing te testen van de WGDs die duidelijk zijn in het SCT-genoom8. Ks distributie van vijf van de zes beschikbare soorten van Lauraceae onthulde twee pieken (Fig. 4b en Supplementary Fig. 16), zoals werd gezien in de SCT Ks distributie (Fig. 4a) en overeenkomt met twee op syntenie gebaseerde gevolgtrekkingen van WGDs in de afstamming van SCT (Fig. 3 en Supplementary Fig. 15). Slechts één Ks piek werd waargenomen in de overblijvende Laurales en Magnoliales soorten, wat suggereert dat slechts één WGD gebeurtenis plaatsvond in de voorouders van deze soorten (supplementaire Figs. 17 en 18). De Ks-piek in de Aquilegia-gegevens is waarschijnlijk toe te schrijven aan WGD binnen de Ranunculales ruim na de divergentie van eudicots en magnoliides (Fig. 4a).

Specialisatie van het proteoom van de magnoliïden

We hebben geprobeerd genen en eiwitdomeinen te identificeren die specifiek zijn voor SCT door domeinen van eiwitfamilies (Pfam) te annoteren en hun distributie te beoordelen over de 13 genomen van zaadplanten die in onze fylogenomische analyses zijn opgenomen. In overeenstemming met de observatie dat er zeer weinig SCT-specifieke orthologe groepen waren, clusterde hoofdcomponentenanalyse van Pfam domeininhoud SCT met de monocoten en eudicoten, waarbij de eerste twee hoofdcomponenten gymnospermen en A. trichopoda van deze groep scheidden (supplementaire Fig. 19a). Er waren aanzienlijke overlappingen tussen SCT, eudicot en monocot soorten, wat wijst op significante functionele diversificatie sinds deze drie lineages zich splitsten. SCT vertoonde ook een significante verrijking en vermindering van respectievelijk 111 en 34 eiwitdomeinen vergeleken met andere plantensoorten (supplementaire Fig. 19b en supplementaire Tabel 9). Tot de toename van eiwitdomeinen behoorden het carboxy-terminale domein van terpeensynthase (TPS) dat betrokken is bij verdedigingsreacties en de leucinerijke herhalingen (628 versus 334,4) in de transpiratie-efficiëntie van planten34. Interessant is dat we ontdekten dat SCT 21 kopieën van de EIN3/EIN3-achtige (EIL) transcriptiefactor bezit, meer dan het eerder gerapporteerde maximum van 17 kopieën in het bananengenoom (Musa acuminata)35. EILs zetten een ethyleensignaleringsrespons in gang door de ethyleenresponsfactor (ERF) te activeren, waarvan wij ook vonden dat hij sterk is uitgebreid in SCT (150 kopieën tegenover een gemiddelde van 68,3 kopieën van negen soorten, gerapporteerd in ref. 35; supplementaire Fig. 20). ERF reageert op en moduleert positief de biosynthese van fytohormonale signalen, waaronder ethyleen36. Expressie van ERF is betrokken bij de positieve modulatie van de ontwikkeling van planten, van vruchtrijping35 tot secundaire groei bij houtvorming37 , alsook bij verhoogde weerstand tegen abiotische38 of biotische39 factoren. Dus, uitbreiding van EILs in SCT kan ERF stimuleren, wat leidt tot verschillende regulaties van downstream effectoren die resulteren in eigenschappen die specifiek zijn voor SCT.

Vervolgens beoordeelden we orthologe groepsuitbreidingen en -inkrimpingen in de zaadplantenfylogenie (Fig. 2). De evolutie van de grootte van de genfamilie was dynamisch doorheen de fylogenie, en de tak die naar SCT leidt, vertoonde geen significant verschillend aantal uitbreidingen en inkrimpingen. Verrijking van Gene Ontology termen onthulde ofwel verschillende genfamilies met gemeenschappelijke functies of enkel-gen families die grote uitbreidingen ondergingen (supplementaire tabellen 10 en 11). Bijvoorbeeld, de uitgebreide leden van plantenresistentie (R) genen tellen op tot “plant-type overgevoelige respons” (supplementaire tabel 10). Daarentegen bevatten de verrijkte Gene Ontology-termen van de gecontracteerde genfamilies van de SCT-tak (aanvullende tabel 11) leden van ABC-transporters, indool-3-azijnzuur-amido synthetase, xyloglucaan-endotransglucosylase/hydrolase en auxin-responsieve proteïne, die alle deel uitmaken van de ‘respons op auxine’.

R-genen

De SCT-genoomannotatie omvatte 387 R-genmodellen, waarvan 82% behoort tot de nucleotide-binding site leucine-rich repeat (NBS-LRR) of coiled-coil NBS-LRR types. Dit resultaat is consistent met een eerder rapport dat LRR een van de meest voorkomende eiwitdomeinen in planten is en het is zeer waarschijnlijk dat SCT in staat is om pathogene producten van avirulentiegenen (Avr) te herkennen en te bestrijden40. Van de 13 bemonsterde genomen herbergt SCT het hoogste aantal R-genen onder de niet-gecultiveerde planten (supplementaire fig. 21). De fylogenetische boom geconstrueerd op basis van 2.465 NBS domeinen suggereert ook dat clades binnen de genfamilie onafhankelijk van elkaar gediversifieerd zijn binnen de eudicoten, monocoten en magnoliiden. Interessant is dat de meest diverse SCT NBS gen clades zuster waren van depauperate eudicot NBS gen clades (Supplementary Fig. 22).

TPS gen familie

Een van de meest opvallende kenmerken van het SCT genoom is het grote aantal TPS genen (CkTPS). In totaal werden 101 CkTPS genen voorspeld en geannoteerd, het grootste aantal voor enig ander genoom tot nu toe. Door het opnemen van een transcriptoom dataset van nog twee soorten magnoliiden (P. americana en Saruma henryi), plaatsten fylogenetische analyses van TPS van 15 soorten CkTPS genen bij zes van de zeven TPS gen subfamilies die zijn beschreven voor zaadplanten41 (Fig. 5, Tabel 1 en supplementaire Figs. 23-28). CkTPS genen die in de TPS-c (2) en TPS-e (5) subfamilies zijn geplaatst coderen waarschijnlijk voor diterpeensynthasen, zoals copalyldifosfaat synthase en ent-kaurene synthase42. Dit zijn belangrijke enzymen die de vorming katalyseren van de 20-koolstof-isoprenoïden (gezamenlijk diterpenoïden genoemd; C20’s), waarvan werd aangenomen dat ze specifiek zijn voor eudicotten41 en primaire functies vervullen, zoals de regulering van het primaire metabolisme van planten. De overige 94 voorspelde CkTPS-genen coderen waarschijnlijk voor de 10-koolstof monoterpeensynthasen (C10), 15-koolstof sesquiterpeensynthasen (C15) en bijkomende 20-koolstof diterpeensynthasen (C20) (Tabel 1). Met respectievelijk 25 en 58 homologen zijn de TPS-a en TPS-b subfamilies het meest divers in SCT, wat vermoedelijk bijdraagt tot de massale en gemengde productie van vluchtige C15’s en C10’s43.

Het is opmerkelijk dat de TPS-genboom Lauraceae-specifieke TPS-genclades binnen de TPS-a, TPS-b, TPS-f en TPS-g gen-subfamilies oploste (supplementaire fig. 23, 24, 27 en 28). Dit patroon van TPS gen duplicatie in een gemeenschappelijke voorouder van Persea en Cinnamomum en daaropvolgende retentie kan wijzen op subfunctionalisatie of neofunctionalisatie van gedupliceerde TPS genen binnen de Lauraceae. Een magnoliide-specifieke subgroep in de TPS-a subfamilie werd ook geïdentificeerd in analyses, die meer magnoliide TPS genen met gekarakteriseerde functies omvatte (supplementaire Fig. 23). We ontdekten inderdaad positieve selectie in de Lauraceae-specifieke TPS-f -I en -II subklassen, wat duidt op functionele divergentie (supplementaire tabel 13). Samen wijzen deze gegevens op toenemende diversificatie van magnoliide TPS genen, zowel voor als na de oorsprong van de Lauraceae.

CkTPS genen zijn niet uniform verdeeld over de chromosomen (Aanvullende Tabel 12) en clustering van leden van individuele subfamilies werd waargenomen als tandem duplicaten (Aanvullende Fig. 29). Zesenzeventig TPS genen werden waargenomen in de grootste 12 scaffolds van SCT. Daarvan werden 60,5% (46 kopieën) behorende tot verschillende subfamilies gevonden in de 0,5-15 Mb en 22,0-24,5 Mb regio van scaffolds 7 en 10, respectievelijk (Supplementary Fig. 29). Scaffold 7 bevat 29 CkTPS genen die tot verschillende subfamilies behoren, waaronder alle acht CkTPS-a, 12 CkTPS-b, vijf CkTPS-e en drie CkTPS-f (Supplementary Fig. 29). Daarentegen bevinden zich slechts twee leden van CkTPS-c in scaffold 1. Vierentwintig CkTPS genen bevinden zich in andere kleinere scaffolds, waarvan er 22 coderen voor de subfamilie TPS-b (supplementaire Fig. 24). Sommige van deze subfamilies op scaffolds 7 en 10 liggen fysiek in elkaars nabijheid (supplementaire Fig. 29). Bijvoorbeeld, 3 van de 11 TPS-b-Lau III subfamilieleden bevonden zich naast 4 van de 11 TPS-b-Lau V subfamilieleden (Supplementaire Fig. 29), terwijl andere subfamilieleden niet in overeenkomstige syntenische regio’s maar elders in het genoom werden aangetroffen (Supplementaire Fig. 30). Genen die tot deze cluster behoren waren niet gegroepeerd in hun overeenkomstige subfamiliefylogenie (supplementaire Fig. 30), wat suggereert dat hun rangschikking recenter zou kunnen hebben plaatsgevonden dan de laatste WGD gebeurtenis.