Ik behoor tot een Hematology Interest Group en geniet altijd van het bekijken van de case studies en vragen die andere techs posten. Deze groep is multinationaal dus ik zie berichten van technici van over de hele wereld. Het is interessant om de gelijkenissen en verschillen te zien in standaard werkwijzen en de rol die technici spelen in verschillende gebieden en verschillende landen. Het is ook interessant om te zien dat we allemaal dezelfde soorten problemen en moeilijke specimens tegenkomen! In de laatste paar maanden heb ik in deze hematologie-interessegroep veel vragen en opmerkingen gezien over het oplossen van samengeklonterde bloedplaatjes, en daarom maak ik van deze gelegenheid gebruik om wat licht te werpen op deze lastige specimens. Het geval dat ik presenteer, en de foto’s, zijn met dank aan Abu Jad Caesar, die Lab manager is bij Medicare Laboratories – Tulkarm branch, in Palestina.
De patiënt had een CBC uitgevoerd op een Nihon Kohden 6410. WBC was 12,7 x 103μL, impedantie aantal bloedplaatjes was 20.000/μL bij eerste run, andere parameters bleken binnen normallimits. Het monster werd opgewarmd en een Na Citraat-buisje werd aangevraagd om pseudothrombocytopenie uit te sluiten.Na opwarming werd de EDTA opnieuw uitgevoerd met een aantal bloedplaatjes van 0/μL. De Na Citraat buis werd uitgevoerd, en het aantal bloedplaatjes van het instrument was 189.000/μL. (Figuur 1) Vanwege de verhouding bloed:antistollingsmiddel in het Na Citraat-buisje werd een vermenigvuldigingsfactor van 1,1 toegepast, waardoor het Na Citraat-bloedplaatjestelling 207.900/μL was. Er werden glaasjes gemaakt, gekleurd en onderzocht. Afbeelding 1 toont de klontering in de EDTA-buis. Afbeelding 2 toont het uitstrijkje uit de Na Citraat-buis, zonder visuele klontering.
De CBC werd gerapporteerd met de volgende opmerkingen:Klontering van bloedplaatjes waargenomen, 2 monsters afgenomen om trombocytopenie uit te sluiten. EDTA volbloed uitstrijkje had veel bloedplaatjes klonten genoteerd (EDTA geïnduceerde trombocytopenie). Conclusie: De bloedplaatjes zijn voldoende en worden geschat op ongeveer200.000/μL.
Tellingen van bloedplaatjes in het normale bereik leveren gewoonlijk niet al te veel problemen op bij de rapportage, zelfs als er enige klontering aanwezig is, voornamelijk omdat ze normaal zijn. Adequate trombocytenaantallen vallen binnen een typisch referentiebereik van ongeveer 150-450 x 103/μL. Als er door het instrument wordt gevlagd voor een abnormaal trombocytenrooster of trombocytenklonters, verdient het aanbeveling de test met een andere methode te herhalen. Als de initiële telling wordt uitgevoerd door impedantietelling, kunnen veel analyzers ook optische of fluorescerende trombocytenaantallen rapporteren. Bij impedantietelling kunnen zeer kleine bloedplaatjes of fragmenten daarvan als bloedplaatjes worden geteld, waardoor het aantal bloedplaatjes ten onrechte toeneemt. Bij optische telling kunnen grote bloedplaatjes als RBC’s worden geteld, wat een valselijk verlaagde telling oplevert. Sommige hematologieanalysers van Sysmex maken gebruik van impedantie en optische tellingen en beschikken ook over fluorescerende trombocytentellingen die gebruik maken van een trombocytenspecifieke kleurstof en nauwkeurige trombocytentellingen geven zonder de interferentie van andere methoden. Een normale trombocytentelling, zelfs met klontering op een uitstrijkje, wordt meestal nog normaal geschat (of kan soms verhoogd zijn.)
Thrombocytopenie daarentegen kan een uitdaging zijn in het hematologielaboratorium. Bij trombocytopenie hebben artsen een nauwkeurige telling nodig om patiënten te diagnosticeren, te behandelen of te controleren. Bij ernstige trombocytopenie kan zelfs een kleine stijging of daling significant zijn. Met minder bloedplaatjes, telt elk bloedplaatje!
Eén van de eerste vragen die we moeten stellen bij een schijnbare trombocytopenie is of dit een echte trombocytopenie is of dat het om een pseudothrombocytopenie (PTCP) gaat. Een echte trombocytopenie is een patiënt met een laag aantal bloedplaatjes, die mogelijk moet worden gecontroleerd of medisch moet worden ingegrepen. Het kan gevaarlijk zijn om trombocytopenie verkeerd te interpreteren, maar het is ook gevaarlijk om een laag aantal bloedplaatjes te melden bij een patiënt met een onechte trombocytopenie die eigenlijk geen trombocytopenie heeft. Pseudotrombocytopenie, of onechte trombocytopenie, wordt gedefinieerd als een kunstmatig of abusievelijk laag aantal bloedplaatjes. Bij PTCP is het lage aantal bloedplaatjes te wijten aan klonters die als 1 bloedplaatje worden geteld. (Deze grote klonters kunnen ook als WBC’s worden geteld, waardoor het aantal WBC’s ten onrechte toeneemt).
We kunnen PTCP in 2 categorieën verdelen Klontering van bloedplaatjes wordt meestal veroorzaakt door pre-analytische fouten zoals te volle of te weinig gevulde EDTA-buizen, samengeklonterde specimens, of een vertraging tussen monsterafname en testen. Technici moeten de buis controleren op stolsels en het monstervolume en een deltacontrole uitvoeren om trombocytopenie van PTCP te kunnen onderscheiden. Maar, met een ogenschijnlijk ‘goed’ monster, zou de volgende stap een uitstrijkje zijn. Als er klonters te zien zijn op het uitstrijkje, dan moeten we beslissen wat de oorzaak van de klonters is. Is het de eerste categorie, een van deze veel voorkomende pre-analytische problemen, of is het de tweede categorie van PTCP, een in-vitro agglutinatie van bloedplaatjes? Omstandigheden die deze in vitro agglutinatie van bloedplaatjes veroorzaken zijn onder andere koude agglutininen, multipel myeloom, infecties, anticardiolipine antilichamen, hoge immunoglobuline niveaus, abciximab therapie en EDTA geïnduceerde pseudothrombocytopenie. (EDTA-PTCP) Van deze is EDTA-geïnduceerde pseudothrombocytopenie de meest voorkomende oorzaak. (Nakashima,2016).
Wanneer techs praten over problemen met bloedplaatjesklontering, is dat meestal omdat we op zoek zijn naar manieren om het aantal bloedplaatjes in deze monsters op te lossen of nauwkeurig te schatten, en er lijkt niet één gemakkelijk antwoord te zijn.De klontering maakt nauwkeurige telling onmogelijk en zelfs schattingen kunnen ergtricky zijn. Hoe kunnen we deze aantallen schatten? Rapporteren we de aanwezigheid van klontering gewoon met “lijkt normaal”, “afgenomen” of “toegenomen”? Of moeten we onze schattingen in meer bereiken opsplitsen om artsen meer waardevolle informatie te geven? En wat als de zorgverlener een werkelijke telling wil om de patiënt de best mogelijke zorg te geven en we de klontering niet kunnen oplossen? Wat kunnen we doen om een telling te geven? Een van de aanbevolen eerste stappen is het monster gedurende 2 minuten te vortexen om de klonters bloedplaatjes op te lossen en vervolgens opnieuw te analyseren. Het verwarmen van monsters kan ook helpen om de klontjes bloedplaatjes op te lossen, vooral bij monsters met koude agglutininen of monsters die te laat zijn getest en bij kamertemperatuur of lager zijn vervoerd of bewaard. Als de klonters blijven bestaan en het opnieuw afnemen van het monster nog steeds klonters in de bloedplaatjes veroorzaakt, kan een pre-analytische fout worden uitgesloten en kan een EDTA-geïnduceerde pseudotrombocytopenie worden vermoed. Veel laboratoria zullen een ander buisje laten trekken of een andere methode gebruiken om de klontering te verhelpen.
Dus, wat is EDTA geïnduceerde trombocytopenie (EDTA-PTCP)? Dit is niet representatief voor een bepaald klinisch beeld, en is niet diagnostisch voor enige aandoening of geneesmiddeltherapie, maar is een laboratoriumverschijnsel als gevolg van de aanwezigheid van EDTA-afhankelijke IgM/IgG autoantilichamen.Deze antilichamen binden zich aan glycoproteïnen van het bloedplaatjesmembraan in aanwezigheid van EDTA. EDTAinduceert en versterkt deze binding door deze glycoproteïnen bloot te stellen aan de antilichamen.(Geok Chin Tan, 2016) Hoewel het een in vitro fenomeen is, hebben patiënten met bepaalde aandoeningen, zoals maligneoplasma’s, chronische leverziekte, infectie, zwangerschap en auto-immuunziekten, wel een verhoogd risico op EDTA-PTCP. EDTA-PTCP is echter ook waargenomen bij patiënten die ziektevrij zijn. (Zhang, 2018)
Wat zijn enkele alternatieve methoden om EDTA-geïnduceerde problemen met klonterende bloedplaatjes te helpen oplossen? Waarschijnlijk de meest gebruikelijke is om het monster opnieuw te trekken in een Na Citraat-buis. Zowel EDTA- als Na Citraat-buisjes moeten worden gebruikt. Bij een echte EDTA-PTCP, zoals in onze casestudie, moeten er klonters te zien zijn op het uitstrijkje uit het EDTA-buisje en geen klonters op het uitstrijkje uit het Na-citraatbuisje. Wegens het volume van het antistollingsmiddel in het Na Citraatbuisje moet u ook de verdunningsfactor van 1,1 toepassen op de telling uit het Na Citraatbuisje om een nauwkeurige telling van de bloedplaatjes te krijgen. Hematologieanalysatoren zijn echter FDA-goedgekeurd en gevalideerd voor gebruik met EDTA-buisjes. Als u een ander stollingsmiddel wilt gebruiken, moet de methode in uw laboratorium worden gevalideerd. Merk ook op dat alternatieve methoden over het algemeen alleen EDTA -PTCP oplossen, en geen klontering ten gevolge van andere koude agglutininen, medicatie of aandoeningen. Bovendien is trombocytopenie ten gevolge van anticoagulantia niet beperkt tot EDTA. Het kan ook voorkomen met citraat en heparine. In een studie werd vastgesteld dat tot 17% van de patiënten met een EDTA -PTCPalsook met citraat dit verschijnsel vertoonde. Onderzoekers hebben zelfs vastgesteld, en wij hebben dat in onze eigen validaties ook gedaan, dat sommige monsters die niet klonteren in EDTA, wel klonteren in Na-citraat. Het is dus mogelijk dat alternatieve buisjes niet alle bloedplaatjesklontering oplossen. (Geok Chin Tan, 2016)
Sommige laboratoria hebben ACD (citroenzuur, trinatriumcitraat, dextrose) antistollingsbuisjes gevalideerd voor EDTA-PTCP. Bij deze methode moeten het EDTA-buisje en het ACD parallel worden uitgevoerd en moet een omrekeningsfactor worden toegepast die het verschil in monsterverdunning in de twee buisjes weergeeft. Om deze vergelijking te maken moet een parameter zoals de RBC worden gekozen. Een formule waarbij het RBC in EDTA wordt gedeeld door het RBC in ACD levert een verhouding op die de verdunningsverschillen tussen de anticoagulantia weergeeft. Deze verhouding kan vervolgens worden vermenigvuldigd met het ACD aantal bloedplaatjes om het ACD gecorrigeerde aantal bloedplaatjes te verkrijgen. (CAP Today, 2014). Sommige bronnen hebben ACD-buisjes aanbevolen omdat de incidentie van klontering met NaCitraat frustrerend hoog kan zijn. De theorie is dat de zuurdere ACD-buisjes het samenklonteren van bloedplaatjes beter kunnen voorkomen dan NaCitraat. (Manthorpe, 1981)
Minder gangbare buisjes zijn CTAD (trinatriumcitraat, theofylline, adenosine, dipyridamole) en heparine. CTAD werkt direct in op bloedplaatjes en remt bloedplaatjesfactor 4, waardoor activering van bloedplaatjes wordt geminimaliseerd. Nadelen van CTAD-buisjes zijn dat zij lichtgevoelig zijn en in het donker moeten worden bewaard, en dat zij kostbaar kunnen zijn. Zij veranderen ook de bloed/additief-verdunningsverhouding, zodat berekeningen moeten worden gebruikt, zoals met Na-citraat en ACD. Heparinebuisjes worden minder vaak gebruikt om problemen met samenklonterende bloedplaatjes op te lossen, omdat heparine de bloedplaatjes kan activeren. Heparinebuisjes zijn ook duurder, zodat zij over het algemeen niet de eerste keuze zijn geweest voor EDTA-PTCP.
Ik heb van laboranten gehoord dat hun laboratoria zeer goede resultaten hebben met amikacine toegevoegd aan EDTA-tubes om onjuiste lage trombocytenaantallen te voorkomen bij patiënten met EDTA-PTCP. Amikacine moet binnen een uur na de afname aan het EDTA-buisje worden toegevoegd en de tests zijn tot 4 uur stabiel bij kamertemperatuur. Uit een in 2011 verrichte studie is gebleken dat de toevoeging van amikacine aan het EDTA-buisje een snelle dissociatie van de bloedplaatjesklonters teweegbrengt, met weinig of geen effect op de morfologie of de indicaties. Deze methode is veelbelovend gebleken voor de rapportage van nauwkeurige trombocytentellingen bij patiënten met multianticoagulant geïnduceerde PTCP. (Zhou, 2011)
De laatste antistollingsbuis die ik door veel technici in de hematologie-interessegroep genoemd heb zien worden, zijn de Sarstedt ThromboExact buizen. Ik heb veel berichten gezien van technici die deze gebruiken en zij schijnen een zeer goed succespercentage te hebben. ThromboExact-buisjes bevatten magnesiumzouten en zijn speciaal ontworpen om het aantal bloedplaatjes te bepalen in gevallen van PTCP. Zij zijn momenteel alleen gevalideerd voor het bepalen van het aantal bloedplaatjes en de monsters zijn tot 12 uur na de afname stabiel.Interessant is dat vóór de geautomatiseerde hematologieanalysatoren magnesium het stollingsmiddel bij uitstek was voor handmatige bepaling van het aantal bloedplaatjes. EDTA-PTCP is erkend sinds de invoering van geautomatiseerde EDTA-bloedplaatjestellingen in de jaren 1970. In een studie van 2013 in Duitsland werden ThromboExact-buisjes gebruikt met uitstekende resultaten voor het oplossen van door multicoagulantia geïnduceerde PTCP. Deze buisjes werden commercieel beschikbaar tijdens de studie, in 2013. (Schuff-Werner, 2013) Helaas voor ons in de Verenigde Staten zijn deze buisjes niet verkrijgbaar in de VS. Ik was onlangs op een conferentie en ging naar de Sarstedt-vertegenwoordigers toe en vroeg naar deze buisjes. Men vertelde mij dat zij in delen van Europa en Azië verkrijgbaar zijn, maar dat zij in de VS niet door de FDA zijn goedgekeurd. Ik vroeg heel hoopvol of zij op zoek waren naar FDA goedkeuring en kreeg helaas te horen dat “zij niet dachten dat zij de markt hadden om goedkeuring na te streven.”
Welke alternatieve methode uw lab ook kiest te gebruiken, het is aan te bevelen een EDTA en de alternatieve buis samen te tekenen. Op deze manier kunnen de 2 tellingen en de aan- of afwezigheid van klontering in de buisjes worden vergeleken. We hebben veel patiënten bij wie één keer klontering optrad, maar wanneer de zorgverlener een Na Citraat-bloedplaatjestelling bestelt, krijgen we een nieuwe trekking van zowel EDTA- als Na Citraat-buisjes samen, en is er geen markering of klontering te zien bij EDTA. In deze gevallen is het juist de EDTA-resultaten te resulteren, aangezien er geen aanwijzingen zijn voor EDTA-PTCP.
Wanneer een patiënt een laag PLT-getal heeft zonder dat eenhematologische ziekte, familieanamnese en/of bloedingsneiging is vastgesteld, en pre-analytische fouten zijn uitgesloten, moet PTCP worden overwogen. Dit betekent niet dat een patiënt met PTCP een normaal aantal bloedplaatjes zal hebben nadat de klontering is opgelost. Zoals hierboven vermeld, hebben veel patiënten met EDTA-PTCPhematologische of andere aandoeningen en kunnen zij werkelijk trombocytopenisch zijn. Het oplossen van de klontering bij deze patiënten stelt ons in staat om de zorgverlener een nauwkeurig aantal bloedplaatjes te geven, wat zeer belangrijk is bij trombocytopenische patiënten.
Het stroomdiagram hieronder (figuur 4) laat een aantal zaken zien waarmee rekening moet worden gehouden bij de behandeling van bloedplaatjesklontering. Het is ons doel om klontering op te lossen, zodat we tijdig een nauwkeurig aantal bloedplaatjes kunnen bepalen. In het laboratorium waar ik werk, heb ik Na-citraatbuisjes gevalideerd, maar deze lijken de klontering bij minder dan 50% van de patiënten op te lossen. Als laatste redmiddel, om een nauwkeurig aantal bloedplaatjes te krijgen, hebben sommige artikelen voorgesteld om een vingerafdruk te nemen en handmatig te tellen. Ik heb dit in de tabel opgenomen als een optie voor multianticoagulant PTCP, maar wegens de moeilijkheid om een goed specimen te verzamelen en de subjectiviteit van de tellingen, samen met de problemen in verband met de nodige berekeningen, hebben onze pathologen besloten dat we geen manuele bloedplaatjestellingen zullen uitvoeren. Daarom ben ik momenteel betrokken bij het toezicht op het samenklonteren van bloedplaatjes en zal ik een kleine interne studie uitvoeren om de ACD-, CTAD- en Na Citraat-buisjes parallel te vergelijken. Afhankelijk van die resultaten zullen we dan misschien ook amikacine testen. Als we tot heldere conclusies komen, zal ik nog een korte blog schrijven met onze resultaten!
Wederom dank aan Abu Jad Caesar, lab manager bij Medicare Laboratories – Tulkarm branch, in Palestina, die mij dit schoolvoorbeeld gaf van een perfect geval van PCTP, dat gemakkelijk kon worden opgelost door opvang in Na Citraat. Ik wou dat ze allemaal hun handboeken lazen en net zo meewerkend waren!
- CAPToday, January 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudothrombocytopenie, In vitro studies naar de onderliggende mechanismen. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia usingan alternative anticoagulant based on magnesium salt. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet clumping: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Ongewenste trombocytopenie in geautomatiseerde bloedplaatjestelling. Laboratoriumgeneeskunde 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. Amikacine kan aan bloed worden toegevoegd om de daling van het aantal bloedplaatjes te verminderen. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM is afgestudeerd aan het Merrimack College in N. Andover, Massachusetts met een BS in Medische Technologie en heeft haar MS in Klinische Laboratoriumwetenschappen afgerond aan de Universiteit van Massachusetts, Lowell. Zij werkt al meer dan 30 jaar als medisch technoloog. Zij heeft gewerkt op alle gebieden van het klinisch laboratorium, maar heeft een speciale belangstelling voor hematologie en bloedbanken. Als ze niet bezig is een gekke wetenschapper te zijn, is ze buiten op de fiets te vinden.