Chemicaliën en reagentia
GT werd gekocht van de markt in Taichung, Taiwan. IS (zuiverheid 97%) werd verkregen van Alfa Aesar (Lancaster, UK). 6,7-dimethoxycumarine (6,7-DMC, zuiverheid 98%) werd geleverd door Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.A.). EC (zuiverheid 90%), ECG (zuiverheid 98%), EGCG (zuiverheid 95%), mierenzuur, probenecide, fosforzuur (glaciaal, 85%) en methylparaben werden gekocht bij Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, U.S.A.). EGC (zuiverheid 92,7%) werd verkregen van ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). en ethylacetaat waren van LC-kwaliteit en werden verkregen van ECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan). Acetonitril was van LC/MS-kwaliteit en werd gekocht bij Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Serum van runderfoetussen werd verkregen van Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israël). Penicilline-streptomycine-glutamine, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, trypsine/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution en 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur werden aangekocht bij Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 werd verkregen van Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). 6-Carboxyfluoresceïne werd gekocht bij AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.) en 5-carboxyfluoresceïne werd verkregen van Acros Organics (Geel, België). Milli-Q plus water (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) werd gebruikt voor alle bereidingen.
Bereiding en karakterisering van GT-infusie
Het infuus werd gemaakt door 2 of 4 g GT gedurende 30 minuten in 50 ml heet gedeïoniseerd water (98-100 °C) te laten trekken. Het aftreksel werd gefiltreerd met gaas terwijl het warm was om concentraties van respectievelijk 40 en 80 mg/ml te verkrijgen, die vers aan ratten werden toegediend via maagsonde.
Voor de karakterisering van GT-infusie, na filtratie van GT-infusie met 0,2 μm RC15-filter (Sartorious, Goettingen Duitsland), werd 100 μl van het filtraat gemengd met 900 μl methanol en gecentrifugeerd om het neerslag te verwijderen. Het naar behoren verdunde infuus (50 μl) werd gecombineerd met 50 μl 6,7-DMC-oplossing (2,0 μg/ml in methanol) als interne standaard en 5 μl werd onderworpen aan LC-MS/MS-analyse. Het HPLC-systeem omvatte een Accela 1250 pomp en een auto-sampler (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). De chromatografische scheiding werd gerealiseerd met een Phenomenex® C18 analytische kolom (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) met een voorfilter. De mobiele fase bestond uit acetonitril met 0,01% mierenzuur (A) en water met 0,01% mierenzuur (B) en werd als volgt gradiëntgewijs geprogrammeerd: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) en 2/98 (12 min). De stroomsnelheid was 0,2 ml/min. De uitstromende kolom werd gedetecteerd met een H-ESI (heated-electrospray ionization) -II probe met Quantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). Als mantelgas werd stikstof gebruikt bij 35 arbitraire eenheden en als hulpgas bij 10 arbitraire eenheden. De botsingsenergie werd ingesteld op -19/18 V, de nevelspanning op -3000/3000 V, de capillaire temperatuur op 350 °C, de verdampingstemperatuur op 350 °C en de offset van de buislens op -80/88 V. De volgende massa-overgangen werden gebruikt voor selected reaction monitoring-analyse (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) en 6,7-DMC (207/151). De ESI-MS spectra werden opgenomen in negatieve ionen mode voor EC, EGC, ECG en EGCG en positieve ionen mode voor 6,7-DMC.
Dieren
Mannelijke Sprague-Dawley ratten (270-360 g) werden gekocht van National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) en gehuisvest in geconditioneerde omgeving met 12-h licht-donker cycli. Voedsel en water werden verkregen ad libitum tot 12 uur voor de experimenten. De ratten werden verdeeld in twee groepen. Het eerste experiment gebruikte 28 ratten om het effect van GT op de serumniveaus van IS en PCS bij CRF-ratten te bepalen; het tweede experiment gebruikte 14 ratten om het effect van GT op de nierfunctie van CRF-ratten te evalueren. Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen van “The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)”, gepubliceerd door de Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. Het experimentele protocol was beoordeeld en goedgekeurd op 08/01/2014 (Vergunningnummer: 103-126-N) door de Insititutional Animal Care and Use Committee van China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Oprichting van CRF-model en toediening van GT-infusie
CRF werd geïnduceerd via orale toediening van adenine naar aanleiding van eerdere studies, maar met enige wijziging19,23,35,36. Kort gezegd werd adenine gesuspendeerd in 0,5% methylcellulose 400 (15 mg / ml) oraal toegediend aan 28 ratten via maagsonde tweemaal daags voor zeven opeenvolgende doses (15 mg / rat) gedurende de gehele experimentele periode. Op dag 4 werden de serumspiegels van IS bepaald. Na bevestiging van de verminderde nierfunctie door significante verhoging van de serumspiegels van IS, werden de CRF-ratten verdeeld in drie groepen (8-10 ratten in elke groep) met vergelijkbare IS-spiegels. De eerste groep kreeg tweemaal daags 400 mg/5 ml/kg GT infusie gedurende zeven opeenvolgende doses; de tweede groep kreeg tweemaal daags 200 mg/5 ml/kg GT gedurende zeven opeenvolgende doses; en de derde groep kreeg parallel 5 ml/kg water als controle. Op dag 8 kregen de ratten de 7de dosis GT toegediend om 9.00 uur na een nacht vasten en werden de bloedstalen verzameld op 0, 15, 30, 60, 120, 180 en 360 minuten na de toediening. De tijdstippen van bloedafname en toediening van adenine en GT zijn samengevat in Fig. 3. Op elk bemonsteringstijdstip werd 0,5 ml bloed afgenomen onder isofluraan anesthesie. De bloedmonsters werden verzameld in microbuisjes en gecentrifugeerd bij 10.000 g gedurende 15 min om serum te verkrijgen, dat werd opgeslagen bij -20 ° C vóór de analyse.
Bepaling van de concentraties van IS en PCS in serum
Voor de bepaling van de concentraties van IS en PCS in serum werd 50 μl serummonster gewerveld met 200 μl methanol dat 10 μg/ml 6,7-DMC of 100 μg/ml methylparaben als interne standaard bevatte, respectievelijk en gecentrifugeerd om het neerslag te verwijderen, waarna een aliquot van 20 μl werd onderworpen aan HPLC-analyse.
Voor ijkstofpreparaten werd 50 μl serum verrijkt met een reeks concentraties van IS en PCS om concentratiebereiken van respectievelijk 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) en 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM) te verkrijgen. De latere procedure volgde die welke hierboven voor serummonsters is beschreven. De ijkcurven werden getekend door lineaire regressie van de piekoppervlakteverhoudingen (IS of PCS ten opzichte van de interne standaard) tegen de bekende concentraties van respectievelijk IS en PCS.
De HPLC-apparatuur omvatte een pomp (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Japan), een fluorescentiedetector (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan) en een automatische injector (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Japan). De Apollo C18-kolom (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) was uitgerust met een guard column (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japan). De mobiele fase bestond uit acetonitril (A)-0,1% fosforzuur (B) en werd als volgt gradiëntgewijs geprogrammeerd: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) en 15/85 (24-35 min) voor IS en 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) en 16/84 (24-36 min) voor PCS. De detectorinstellingen waren Ex 280 nm/Em 375 nm voor IS en Ex 214 nm/Em 306 nm voor PCS. De stroomsnelheden waren 1,0 ml/min.
Effect van GT op Cr en BUN bij CRF-ratten
In een ander experiment werd hetzelfde dierprotocol gebruikt als hierboven vermeld en werden de concentraties van Cr en BUN bepaald vóór adeninebehandeling (Dag 0), vóór GT-dosering (Dag 4) en na 7e dosis GT (Dag 8). Na bevestiging van de verminderde nierfunctie door significante verhoging van Cr en BUN op dag 4, werden de CRF-ratten verdeeld in twee groepen (7 ratten per groep) met vergelijkbare Cr-niveaus. De eerste groep kreeg tweemaal daags 400 mg/5 ml/kg GT gedurende zeven opeenvolgende doses; de tweede groep kreeg parallel 5 ml/kg water als controle. Op dag 8 kregen de ratten de 7de dosis GT en water toegediend nadat ze ’s nachts hadden gevast en de bloedmonsters werden 30 min later afgenomen. Cr werd bepaald met een kinetische alkalische picraatmethode in een ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). BUN werd bepaald door de urease/glutamaat dehydrogenase gekoppelde-enzymreactie met hetzelfde analyseapparaat.
Cellijn en kweekomstandigheden
Constructie van de stabiel getransfecteerde cellijnen gebruikt voor transport studies, Chinese hamster eierstok (CHO) cellen die hOAT1 (CHO-hOAT1), menselijke embryonale nier 293 (HEK) cellen die hOAT3 (HEK-hOAT3) en hun overeenkomstige lege vector-getransfecteerde controle cellijnen, werd eerder beschreven40,41. CHO cellen werden gehandhaafd bij 37 ° C met 5% CO2 in DMEM F-12 media (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) met 10% serum, 1% penicilline / streptomycine en 1 mg / ml G418. HEK-cellen werden bewaard bij 37 °C met 5% CO2 in DMEM hoge glucose media (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) met 10% serum, 1% penicilline/streptomycine en 50 μg/mL hygromycine B. Cellen werden gekweekt in Poly-D-Lysine gecoate schalen.
Preparatie en karakterisering van de serummetabolieten van GT (GTM)
Om de moleculen die in wisselwerking staan met OATs in vivo na te bootsen, werden GTM van ratten bereid en gekarakteriseerd. Kort samengevat werd GT infusie (800 mg/10 ml/kg) oraal toegediend aan ratten die ’s nachts vastten. Bloed werd 15 min. na het toedienen van GT infusie afgenomen. Na coagulatie werd het serum verzameld en gevortexeerd met 3-voudige methanol. Na centrifugatie bij 10.000 g gedurende 15 minuten werd het supernatans in een roterende verdamper onder vacuüm tot droogte geconcentreerd. Een passend volume water werd toegevoegd aan het residu, waardoor een oplossing met 10-voudige serumconcentratie werd verkregen, die in aliquots werd verdeeld en bij -80 °C werd bewaard voor later gebruik.
Een gedeelte van GTM werd gekarakteriseerd volgens een eerdere methode met enkele wijzigingen16,46. In het kort werd 100 μl serummonster gemengd met 50 μl sulfatase (met 1000 eenheden/ml sulfatase en 39 861 eenheden/ml ß-glucuronidase), 50 μl ascorbinezuur (200 mg/ml) en bij 37 °C gedurende 45 min. onder anaërobe omstandigheden geïncubeerd. Na hydrolyse werd het serum toegevoegd aan 50 μl 0,1 N HCl en vervolgens verdeeld met 250 μl ethylacetaat (dat 100 ng/ml 6,7-DMC als interne standaard bevat). De ethylacetaatlaag werd onder N2 ingedampt tot droogte en gereconstitueerd met een geschikt volume mobiele fase voorafgaand aan LC-MS/MS-analyse. De mobiele fase bestond uit acetonitril (A) – water met 0,1% mierenzuur (B) en werd als volgt in een gradiënt geprogrammeerd: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) en 2/98 (12 min). De stroomsnelheid was 0,2 ml / min.
Effecten van GTM op de opname transport gemedieerd door hOAT1 en hOAT3
CHO-hOAT1 en HEK-hOAT3 cellen (1 × 105 cellen / putje) werden gekweekt in een 96-well plaat. 6-Carboxyfluoresceïne (6-CF) en 5-carboxyfluoresceïne (5-CF) werden gebruikt als probes voor het evalueren van het effect van GTM op de activiteit van hOAT1 en hOAT3, respectievelijk47,48. Bovendien werd probenecid (80 μM) gebruikt als een positieve controle voor remming van hOAT1 en hOAT349. Na 24 uur of 48 uur incubatie van CHO-hOAT1 of HEK-hOAT3, werd het medium verwijderd en drie keer gewassen met PBS-buffer. Vóór het transportexperiment werden CHO-hOAT1- en HEK-hOAT3-cellen voorgeïncubeerd met teststoffen (GTM en probenecid) bij 37 °C. Na 30 min incubatie werd 6-CF of 5-CF toegevoegd en nog eens 5 min en 10 min geïncubeerd, respectievelijk. De platen werden onmiddellijk geplaatst op ijs bad en het supernatants werden verwijderd en de cellen werden driemaal gewassen met ijskoud PBS. Vervolgens werd 100 μl 0,1% Triton X-100 toegevoegd om de cellen te lyseren en de fluorescentie werd gemeten met excitatie bij 485 nm en emissie bij 528 nm. Om het eiwitgehalte in elk putje te kwantificeren, werd 10 μl cellysaat toegevoegd aan 200 μl verdund eiwitbepalingsreagens (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) en werd de optische dichtheid gemeten bij 570 nm. De relatieve intracellulaire accumulatie van 6-CF of 5-CF werd berekend door vergelijking met die van controles na eiwitcorrectie.
Gegevensanalyse
De piekserumconcentratie (Cmax) werd verkregen uit experimentele waarneming. De oppervlakte onder de serumconcentratie – tijdcurve (AUC0-t) werd berekend met behulp van de trapeziumregel tot het laatste punt. De verschillen van IS en PCS tussen drie groepen werden geanalyseerd met behulp van eenzijdige ANOVA, terwijl het verschil van Cr en BUN tussen twee groepen werd geanalyseerd met behulp van ongepaarde Student’s t-test, waarbij p < 0,05 als significant niveau werd genomen. Ongepaarde Student’s t-test werd ook gebruikt voor de analyse van in vitro assays.