Initiële problemenEdit
ThermolabiliteitEdit
Initiële toepassing van het FLP-FRT recombinase werkte niet bij zoogdieren. Het FLP eiwit was thermolabiel (denatureert bij verhoogde temperaturen) en was daarom niet bruikbaar in het zoogdiermodel vanwege de verhoogde lichaamstemperaturen van deze modelsystemen. Als gevolg van octrooien en beperkingen op het gebruik van Cre-Lox recombinatie, werd echter grote belangstelling getoond voor de productie van een meer thermostabiele FLP-FRT cassette. Enkele van de eerste resultaten werden geproduceerd door Buchholz et al. (1997) door gebruik te maken van cyclische mutagenese in Escherichia coli . In hun onderzoek transfecteerden de auteurs E. coli-cellen met twee plasmiden: één dat codeert voor willekeurig gemuteerde FLP-eiwitten stroomafwaarts van een arabinosepromotor en een ander dat een lacZ-genpromotor binnen een FRT-cassette bevat. De E. coli werden gekweekt op arabinoseplaten bij 37 °C en 40 °C, en als er recombinatie optrad, werd de expressie van het lacZ-gen verzwakt en zagen de kolonies er wit uit. Van elke generatie werden witte kolonies geselecteerd en gedurende acht generaties op nieuwe arabinoseplaten bij dezelfde eerdere temperaturen gekweekt. Nadat recombinatie was bevestigd met behulp van western-blotting en de gemuteerde FLP-genen waren gesequenced, werd deze achtste generatie FLP-eiwit (FLPe) getransfecteerd in zoogdiercelcultuur, en werd recombinatie in zoogdiercellen bevestigd. Deze variant van FLP heeft slechts 4 aminozuursubstituties: P2S, L33S, Y108N, en S294P.
generatie van genetische mozaïekenEdit
Genetisch mozaïek ontstaat binnen een organisme wanneer gelijksoortige celtypen verschillende fenotypen tot expressie brengen als gevolg van ongelijke genotypen op specifieke loci. Eenvoudig gezegd, dit doet zich voor wanneer één organisme verschillende genotypen bevat, wat in de natuur meestal zeldzaam is. Dit kan echter gemakkelijk (en problematisch) worden geproduceerd met behulp van FLP-FRT recombinatie. Als in een cel twee verschillende FRT-locaties aanwezig zijn, en FLP in de juiste concentraties aanwezig is, zal de FRT-cassette steeds verder worden uitgesneden en tussen de twee FRT-locaties worden ingevoegd. Dit proces gaat door totdat de FLP-eiwitten onder de vereiste concentraties komen, waardoor cellen binnen een organisme verschillende genotypen gaan bezitten. Dit is waargenomen van fruitvliegen tot muizen en is ongedifferentieerd tegen specifieke chromosomen (somatisch en geslacht) of celtypes (somatisch en kiembaan).
Bepaling van cellijnenEdit
Vóór de publicatie van Dymecki et al. (1998), was Cre recombinase gebruikt voor het in kaart brengen van de celtoestand van neuronale progenitors bij muizen met behulp van de En2 promoter. De auteurs van Dymecki et al. (1998) theoretiseerden dat FLP recombinase op een gelijkaardige manier zou kunnen gebruikt worden met een gelijkaardige doeltreffendheid als Cre recombinase bij muizen. De auteurs creëerden twee transgene muizenlijnen: een neuronale Wnt1::Flp fusielijn en een lijn die de FRT cassette bezat die het 18de exon van tm1Cwr flankeerde. De auteurs kozen dit exon voor excisie omdat als het geëxcideerd is, het resulteert in een nihil fenotype. De auteurs paarden de twee lijnen en lieten de nakomelingen volwassen worden voordat de nakomelingen werden opgeofferd. RNA-extractie werd uitgevoerd op neuronaal, spier-, enterisch en staartweefsel. Omgekeerde transcriptie PCR en noordelijke blotting bevestigden de excisie van het 18e exon van tm1Cwr overvloedig in het hersenweefsel en matig in het spierweefsel (als gevolg van Scwhann cellen binnen de spier). Zoals verwacht werd excisie niet waargenomen in andere weefsels. De auteurs zagen een gelijke, zo niet betere, efficiëntie van het FLP recombinase in de bepaling van het cel lot dan Cre recombinase.
In Drosophila melanogaster (Fruitvlieg)Edit
Tot op heden is Flp recombinase vele malen gebruikt in D. melanogaster. Een vergelijking van Flp recombinase met Cre recombinase in D. melanogaster werd gepubliceerd door Frickenhaus et al. (2015). De auteurs van Frickenhaus et al. (2015) hadden een tweeledig doel: karakteriseren en vergelijken van de werkzaamheid van Flp recombinase “knock-out” met Cre recombinase “knock-out” en RNAi knockdown en het onthullen van de functie van cabeza (caz), de vlieg ortholoog van FUS, in de neuronen en het spierweefsel van D. melanogaster. FUS is sterk betrokken bij amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie bij de mens. De auteurs gebruikten een elav-Gal4/UAS-Flp of Cre systeem om het recombinase specifiek in neuronen tot expressie te brengen en een Mef2-Gal4/UAS-Flp of Cre systeem om het specifiek in spieren tot expressie te brengen. De auteurs concluderen dat de Flp recombinase “knock-out” tool effectiever is dan zowel RNAi en Cre recombinase voor het doel van het uitschakelen van specifieke genen in specifieke weefsels of cellijnen als gevolg van het ontbreken van de lekke expressie gezien in zowel de Cre eiwit en de RNAi transcript. Ook waren de auteurs getuige van een toxiciteit voor het Cre eiwit die niet wordt gezien met het Flp eiwit.
In Danio rerio (zebravis)Edit
De werkzaamheid van het FLPe recombinase systeem werd geëvalueerd in zebravissen door Wong et al. (2009). Embryo’s, die hemizygoot waren voor een FRT-geflankeerd versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) stroomafwaarts van een spierspecifieke promoter, werden geïnjecteerd met het FLPe eiwit. Zonder FLPe zouden deze embryo’s EGFP tot expressie moeten brengen in al het spierweefsel, en indien gekruist met een wild-type streng, zou 50% van de resulterende nakomelingen ook EGFP tot expressie moeten brengen in spierweefsel. Bij met FLPe geïnjecteerde embryo’s was de EGFP-expressie in het spierweefsel aanzienlijk verlaagd, en werd ook mozaïcisme gezien. Toen deze embryo’s volwassen werden, werden ze gepaard met een wildtype stam, en de resulterende koppels hadden aanzienlijk minder nakomelingen die EGFP in het spierweefsel tot expressie brachten (0-4%). Deze resultaten tonen aan, dat FLPe niet alleen zeer effectief is in somatische cellen, maar ook in de kiembaan van zebravissen,
In plantenEdit
Creatie van “fytosensoren” of “sentinels” in Arabidopsis thaliana en TobaccoEdit
Fytosensoren zijn genetisch gemodificeerde planten die de aanwezigheid van biotische of abiotische contaminanten kunnen rapporteren. Het is duidelijk dat de productie van deze gemanipuleerde planten een grote belofte inhoudt voor de landbouw en het laboratorium. Het creëren van een geschikte reportervector is echter problematisch gebleken. cis-regulerende elementen spelen een belangrijke rol bij de transcriptionele activering van genen in planten, en vele daarvan worden niet goed begrepen. Veel fytosensoren brengen hun reportergenen te weinig tot expressie of melden vals-positieven als gevolg van synthetische promotors. De auteurs van Rao et al. (2010) gebruikten het FLP recombinase tool voor de productie van een zeer efficiënte fytosensor. De auteurs gebruikten een heat-shock promoter om de productie van FLP te induceren, terwijl een FRT-geflankeerde vector de CaMV 35S promoter scheidde van het beta-glucuronidase gen (GUS). Wanneer de planten werden blootgesteld aan een hitteschok, leidde FLP-inductie tot excisie van de FRT-geflankeerde vector, waardoor het GUS-gen direct downstream van de CaMV 35S-promotor kwam te liggen. De activering van GUS leidde tot de bladeren van de planten om te veranderen van groen naar blauw; dus, de fytosensor effectief gemeld stress aan het modelsysteem!
Met Cre-recombinaseEdit
Productie van de gate-way-ready induceerbare MiRNA (GRIM) expressiesysteemEdit
RNA-interferentie (RNAi) heeft geleid tot een paradigmaverschuiving in de expressie van genen en potentiële gen knock-outs in Eukaryoten. Vóór de productie van het GRIM-expressiesysteem was de aanmaak van RNAi-vectoren duur en tijdrovend. De vectoren werden geproduceerd door middel van de traditionele “copy-and-paste” moleculaire kloneringsmethode. Garwick-Coppens et al. (2011) ontwikkelden een veel efficiëntere methode voor de productie van RNAi-vectoren waarbij de expressie van het RNAi kan worden ingebouwd met Cre-recombinase en uitgeschakeld met Flp-recombinase. Het nieuwe GRIM Expression System maakt het mogelijk veel sneller expressievectoren te genereren die kunstmatige RNAi-constructen bevatten. De auteurs toonden verder aan dat hun expressiesysteem vrij effectief werkt in menselijke embryonale nieren (HEK) cellen, een veel voorkomende menselijke geïmmortaliseerde cellijn in moleculair onderzoek.