FFPE-monsters – Voorbereiding van menselijk weefsel – Lab-Ally

Inleiding

Inleiding |Weefselverkrijging |FFPE-weefselverwerking |Doorsnijden |Referenties

Als u FFPE-monsters of andere menselijke biospecimens nodig hebt voor uw onderzoek, neem dan contact met ons op.

Inleiding

Veel van de hedendaagse onderzoekers geven er de voorkeur aan FFPE-weefselmonsters te gebruiken voor hun IHC-, histologische of in-situ-genomische analyses. FFPE staat voor “Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” en beschrijft de twee belangrijkste kenmerken van deze methode van weefselconservering. Formalin is een formaldehyde-oplossing en wordt gebruikt sinds de ontdekking van de conserverende werking van formaldehyde door de Duitse arts Ferdinand Blum aan het eind van de 19e eeuw (Fox, et al., 1985). Paraffine wordt in het weefsel ingebracht na fixatie met formaldehyde, en het weefsel wordt ook omgeven met een paraffine omhulsel om het te helpen ondersteunen en het te beschermen tegen oxidatie. Professioneel gefixeerde en ingebedde FFPE-monsters en de biomoleculen die ze bevatten, zijn redelijk stabiel bij omgevingstemperatuur. Structureel zijn de gefixeerde en ingebedde weefsels veerkrachtig en kunnen ze bijna onbeperkt worden gebruikt voor microscopisch anatomisch onderzoek, maar na verloop van tijd zal de antigeniciteit van sommige eiwitten degraderen, waardoor IHC-onderzoek beperkt blijft tot monsters die niet ouder zijn dan enkele tientallen jaren. Dubbelstrengs DNA is verrassend stabiel in FFPE-blokken, maar andere minder stabiele biomoleculen zoals RNA kunnen binnen een decennium of minder worden afgebroken, vooral wanneer de coupes eenmaal zijn doorgesneden.

Archieven waarin grote aantallen FFPE-monsters zijn verzameld, zijn een bijzonder rijke bron van gegevens wanneer vergelijking van vele gevallen (d.w.z. FFPE-monsters van meerdere donoren) wenselijk is om statistisch robuuste conclusies te kunnen trekken over de kenmerken van bepaalde indicaties. Als de FFPE monsters gebruikt gaan worden in “high stakes” biomedisch onderzoek, dan is het belangrijk dat elke fase van het preparatieproces wordt uitgevoerd door volledig opgeleide en gecertificeerde professionals, bij voorkeur in een CLIA gecertificeerd (d.w.z. door de overheid geïnspecteerd) of CAP geaccrediteerd (College of American Pathologists) laboratorium.

Er zij op gewezen dat het FFPE-proces niet universeel gestandaardiseerd is, en dat instellingen over de hele wereld enigszins verschillende protocollen met verschillende formalineoplossingen kunnen gebruiken of het proces anderszins aan hun voorkeuren en eisen kunnen aanpassen. Wat volgt is een overzicht van het proces en beschrijvingen van wat elke stap inhoudt, evenals enkele veel voorkomende variaties.

Weefselverkrijging

Vóór de weefselverwerking is de noodzakelijke stap van weefselverkrijging. Dit is eigenlijk het moeilijkst te controleren element, omdat het verweven is met de patiëntenzorg, de naleving van de 41 CFR46 en, in de VS, het toezicht door de interne beoordelingsraad (IRB). De bijzonderheden van de medische procedure en de conventies van de standaardzorg zijn belangrijk omdat zij variabelen kunnen beïnvloeden zoals het tijdsinterval tussen de toediening van de anesthesie en het afbinden van de vaten, de verwijdering van het weefsel en de tijd die verstreken is vóór de fixatie, die allemaal een invloed kunnen hebben op de kwaliteit van het specimen. Zo zullen zich waarschijnlijk veranderingen in RNA en eiwitten voordoen tijdens het tijdsinterval, de zogenaamde warme ischemietijd, tussen de ligatie van de bloedtoevoer en de weefselafname (Dash, et al., 2002). Deze ischemietijd kan variëren van minuten tot uren, afhankelijk van het orgaan, de standaardwerkwijzen van de instelling, de chirurg en ander betrokken gezondheidszorgpersoneel, en de chirurgische aanpak. Daarom wordt aanbevolen deze tijd voor elk monster te registreren en tot een minimum te beperken (Hewitt, et al., 2008).

FFPE-weefselverwerking

Zodra het weefselmonster is verkregen, kan extra triage, dissectie of microdissectie (samen “grossing” genoemd) nodig zijn om het specifieke deel van het weefsel dat de resterende verwerkingsstappen zal ondergaan, te isoleren en voor te bereiden. De weefselverwerking is tegenwoordig vaak volledig geautomatiseerd tot en met de laatste stap, het inbedden, die manueel kan worden uitgevoerd. Er zijn vele weefselprocessoren beschikbaar, maar alle volgen de volgorde van de eerste vier stappen die hierboven zijn aangegeven. De automatisering van de verschillende stappen helpt om variaties in de procedure als een bron van variatie van experimentele resultaten tussen verschillende FFPE monsters te elimineren.

Fixatie

Fixatie is de eerste stap in FFPE weefselverwerking. Kritische factoren zijn onder meer de te gebruiken oplossing, de duur van de fixatie en de dikte en histologische eigenschappen van het te fixeren weefselmonster.

– Oplossing

Het fixeermiddel dat door de meeste laboratoria wordt gebruikt, is neutraal gebufferde 10% formaline. Formaline is een vloeistof die bestaat uit 37-40% formaldehyde en 10% methanol (in gewicht) in water; een 10% formalineoplossing bevat dus ongeveer 3,7% – 4% formaldehyde en 1% methanol (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). In werkelijkheid bestaat formaldehyde in oplossing hoofdzakelijk als monomeren of kleine polymeren van methyleenglycol (methanediol, formaldehyde monohydraat), dat wordt gevormd door de omkeerbare reactie van formaldehyde met water. Polymeren van methyleenglycol met een hoog gewicht worden paraformaldehyde genoemd en zullen uit de oplossing neerslaan, maar methanol vertraagt dit polymerisatieproces, hetgeen de reden is waarom het in formalineoplossingen is opgenomen. Formaline verdund met water (zoals 10% formaline) – en vooral als het een bufferoplossing is – zal hoofdzakelijk monomeren bevatten omdat het grote aantal watermoleculen de methyleenglycolpolymeren afbreekt die normaal in een oplossing met een hogere formaldehydeconcentratie aanwezig zouden zijn geweest (Kiernan, 2000). Buffers, het resterende bestanddeel van formaline, worden ook toegevoegd omdat formaldehyde de neiging heeft te oxideren tot mierenzuur (Fox, et al., 1985). Mierenzuur bij weefselfixatie kan leiden tot het neerslaan van formalinepigmentkorrels (zure hematine) die kunnen lijken op pigmenten die door sommige parasieten worden geproduceerd (Pizzolato, 1976). Buffering van formaline voorkomt dat dit gebeurt. Veel gebruikte buffers zijn magnesiumcarbonaat, calciumcarbonaat, citraat, Tris, en fosfaatbuffers (Hewitt, et. al., 2008). Commerciële formaline bevat vaak fosfaatbuffers. “Neutraal gebufferd,” wat typisch is hoe formaline wordt bereid, betekent gewoon dat de pH op ongeveer 7 wordt gehouden.

– Proces en mechanisme

Omwille van de lage molecuulgewichten van formaldehyde en methyleenglycol, dringt formaline (voornamelijk methyleenglycol in oplossing) relatief snel door in weefsels, met een snelheid die afhangt van het weefseltype, maar met een gemiddelde snelheid van 1 mm/uur (Hewitt, et al., 2008). Protocollen voor fixatie zullen dus variëren naargelang van het type weefsel dat moet worden gefixeerd. Eenmaal in het weefsel zal de fractie formaldehydemoleculen in oplossing beginnen te crosslinken met eiwitten, maar dit gebeurt veel trager dan de snelheid van diffusie. De reactie van formaldehyde met het weefsel trekt het uit de oplossing en trekt die omkeerbare formaldehyde-naar-methyleenglycol-reactie terug in de richting van formaldehyde, zodat er meer van wordt geproduceerd, terwijl het ook wordt verbruikt (Fox, et al., 1985). Lysine amino zijketens zijn het meest reactief met formaldehyde, maar anderen die enigszins reactief zijn met formaldehyde zijn arginine, asparagine, histidine, glutamine, serine, en tyrosine (Howat en Wilson, 2014). Na de reactie kan de resulterende hydroxymethylgroep die aan het complex vastzit verder reageren met hetzelfde eiwit of andere eiwitten, waardoor stabiele methyleenbruggen worden gevormd (eiwit-CH2-eiwit) (Kiernan, 2000). Dit veroorzaakt de onoplosbaarheid en stijfheid van weefsels die met formaline zijn gefixeerd en zo zijn geconserveerd. Ongeveer 24-48 uur zijn nodig om deze cross-linking voldoende in het weefsel te laten plaatsvinden (Thavarajah, et al., 2012), maar er is aanbevolen niet meer dan 36 uur voor dit proces toe te staan, omdat fixatie voor een langere periode de kwaliteit van biomoleculen in de FFPE monsters zal verminderen, zoals door het verkorten van de lengte van nucleïnezuren die kunnen worden geëxtraheerd (Hewitt, et al., 2008).

– Beperkingen

Het grote voordeel van het gebruik van formaldehyde – vooral als neutraal gebufferde, 10% formaline – is dat het een breed scala van weefsels en componenten conserveert. Het heeft echter beperkingen. Bijvoorbeeld, een combinatie van formaldehyde met glutaaraldehyde (C5H8O2), of een oplossing van glutaaraldehyde alleen, wordt typisch gebruikt voor elektronenmicroscopie (Kiernan, 2000) aangezien die oplossingen beter zijn voor het bewaren van weefselstructuren voor dat doel. Merk op dat weefsels die bereid zijn met een glutaaraldehyde- of glutaaraldehyde-aldehydeoplossing niet als FFPE-monsters worden beschouwd. Een andere uitdaging is het terughalen van DNA- en RNA-moleculen uit FFPE-weefsel, aangezien formaline de neiging heeft nucleïnezuren te wijzigen – zelfs zodanig dat kunstmatige mutaties in het DNA worden aangebracht – en ze in kleine fragmenten op te splitsen (Srinivasan, Sedmak, and Jewell, 2002). Toch is het mogelijk om DNA en RNA fragmenten uit FFPE weefsel dat geschikt zijn voor analyse, zoals beschreven in een protocol geschreven door Tang, et al. (2009), met een belangrijke factor in nucleïnezuur herstel zijn juiste protease digestie extraheren. Commerciële kits voor nucleïnezuurextractie uit FFPE monsters zijn ook beschikbaar.

– Specimen dikte

Een ander belangrijk punt om te overwegen met betrekking tot formaline fixatie is de dikte van het weefselmonster. Hoewel formaline relatief snel in het weefsel doordringt, zal, zoals hierboven vermeld, de dikte van het weefsel van invloed zijn op de kwaliteit van het gefixeerde monster. Er zal meer tijd nodig zijn voor formaline om het centrum van dikkere weefselmonsters te bereiken. Terwijl de formaline geleidelijk in het binnenste van het monster doordringt, is het fixatieproces in de buitenste regio’s reeds begonnen, zodat de biomoleculen daar eerder zullen degraderen in de lange tijd die nodig is voor totale fixatie. Bovendien bestaat de mogelijkheid dat, indien tijdslimieten in acht worden genomen (zoals een maximum van 36 uur zoals hierboven vermeld), het weefselmonster niet in zijn geheel voldoende gefixeerd (geconserveerd) zal zijn. Daarom kunnen weefsels voor fixatie die breder zijn dan enkele millimeters of misschien één of twee centimeter, beter in dunnere segmenten worden ontleed voor een optimale fixatie (Hewitt, et al., 2008). Instellingen kunnen verschillende protocollen hebben voor de tijdsduur en het volume fixatief dat nodig is voor weefselmonsters van verschillende breedtes, maar in het algemeen moet de verhouding tussen het volume fixatief en het volume weefsel 10:1 zijn (Klatt, 2016).

Dehydratie

De tweede stap in de verwerking van FFPE-specimen is dehydratie. Omdat paraffine onvermengbaar is met water, moet al het water uit de formalineoplossing uit het weefsel worden verwijderd voordat paraffine het kan infiltreren. Een reeks alcoholoplossingen (vaak ethanol), vaak beginnend met 70% en oplopend tot 100% alcohol, zal worden gebruikt om in wezen al het water uit het weefsel te verwijderen. Voor een optimale dehydratie moeten verse oplossingen worden gebruikt of moeten gebruikte oplossingen regelmatig worden vervangen, omdat de alcohol na gebruik steeds meer verdund raakt. Het is ook noodzakelijk dat deze stap volledig wordt voltooid (met voldoende tijd gereserveerd voor deze stap), omdat onvoldoende uitdroging kan leiden tot weefselafbraak (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Since paraffine is eigenlijk ook niet mengbaar in alcoholen, de volgende stap is om de alcohol te verwijderen met een stof die mengbaar is met paraffine. Deze stap staat bekend als klaren, en xyleen is het klaringsmiddel dat het vaakst wordt gebruikt (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Paraffine-infiltratie

Na adequate fixatie, dehydratie en klaring kan het weefsel ten slotte paraffine-infiltratie (of impregnatie) ondergaan. Ook deze stap is niet gestandaardiseerd, en instellingen van over de hele wereld kunnen verschillende paraffines en wasmengsels van verschillende samenstelling gebruiken. Paraffines hebben verschillende smeltpunten en texturen die van invloed zijn op het uiteindelijke weefselblok en de kenmerken daarvan. In de Verenigde Staten en West-Europa worden gewoonlijk synthetische paraffines met een laag smeltpunt (55°C-63°C) gebruikt voor de beste resultaten. Latex, dimethylsulfoxide en eigen “weekmakers” kunnen in de formulering worden opgenomen om de textuur en de kneedbaarheid van het uiteindelijke weefselmonster te wijzigen (Hewitt, et al., 2008).

Naties uit andere delen van de wereld zullen vaak bijenwas in hun formuleringen opnemen om de kneedbaarheid te verbeteren en de smelttemperatuur van de gebruikte paraffines van lage kwaliteit te verlagen. Bijenwas bevat echter verontreinigingen zoals stuifmeel en vermindert de kwaliteit van het uiteindelijke monster. Hogere smelttemperaturen moeten worden vermeden omdat zij later resulteren in verminderde en onvoldoende deparaffinering van het weefselspecimen, alsook een daling van de hoeveelheid nucleïnezuren die uit het weefsel worden teruggewonnen (Hewitt, et al., 2008).

Paraffine Inbedden

De laatste stap in de verwerking van FFPE-monsters is het paraffine-inbedden. Het weefselmonster geïnfiltreerd met paraffine wordt omgeven met een laag paraffine. Er moet voor worden gezorgd dat het weefselblok correct in de mal (“cassette”) wordt georiënteerd, omdat dit van invloed is op het vlak van snijden wanneer dunne secties van het blok worden gesneden met een microtoom (Klatt, 2016). Zodra het paraffineomhulsel is gestold, is het FFPE-blok klaar voor opslag en blijft het jarenlang goed bewaard, zelfs tot tientallen jaren (Hewitt, et al., 2008).

Sectie

Als het weefsel eenmaal is ingebed, is het klaar voor sectie op het microtoom. Aangezien het weefsel niet altijd volledig vlak tegen de voorzijde van de paraffine ligt, moet de histotechnoloog meestal in het blok “kijken”. Het weefselblok wordt in de blokhouder van het microtoom geplaatst en de histotechnoloog draait aan het handwiel, terwijl hij de hoek van de blokhouder bijstelt om zo weinig mogelijk weefsel te verspillen, waardoor het blok op en neer wordt bewogen tegen een scherp mes. Het blok wordt doorgesneden tot een volledig representatief deel van het weefsel zich aan de voorkant van het blok bevindt. Zodra het weefsel vooraan ligt, wordt het blok op ijs gelegd om af te koelen, wat het snijden van dunne coupes zal vergemakkelijken; paraffine die te warm is, zal samengedrukt weefsel met gerimpelde coupes doen ontstaan. Wanneer het blok is afgekoeld, wordt het teruggeplaatst in de blokhouder. De technicus draait opnieuw aan het handwiel, dit keer in een langzaam, gelijkmatig tempo om opeenvolgende dunne coupes te maken die aan elkaar kleven en een “lint” vormen.” Het lint wordt op een warm waterbad gelegd (de temperatuur wordt net onder het smeltpunt van de paraffine gehouden) om eventuele rimpels die zich hebben gevormd glad te strijken. De technicus plaatst vervolgens een microscoopglaasje in het waterbad en “schept” de gekozen sectie(s) op, zodat ze aan het glaasje blijven kleven.

De meest gebruikelijke dikte voor weefselsecties is tussen 3-5 micrometer (of kortweg micron), wat de dikte van een enkele cel is. Glaasjes met doorsneden van 3-5 micron worden gewoonlijk gebruikt voor kleuring, of het nu de standaard Hematoxylin & Eosin (H&E) kleuring, speciale kleuring, of immunohistochemische (IHC) kleuring is. Onderzoekers vragen vaak om “krullen” in plaats van dunne coupes op objectglaasjes. Curls zijn dikkere secties (10 micron of meer) die in Eppendorf buisjes worden gedaan en over het algemeen worden gebruikt wanneer RNA of DNA uit de FFPE monsters moet worden geëxtraheerd. Dikke coupes kunnen ook op objectglaasjes in plaats van buisjes worden gedaan; dit is optimaal wanneer slechts een deel van het weefsel voor extractie zal worden gebruikt. In dat geval wordt het weefsel van het objectglaasje geschraapt en in een buisje gedaan. FFPE-monsters die zijn doorgesneden zijn structureel stabiel, en als ze goed worden behandeld en bewaard kunnen ze nog enige tijd na het doorsnijden worden gebruikt voor microscopische analyse, maar als er chemische extracties moeten worden uitgevoerd, moeten de coupes over het algemeen zo snel mogelijk na het doorsnijden worden gebruikt om oxidatieve en biologische afbraak van de blootliggende doelmoleculen te voorkomen.

Op zoek naar informatie over de histologie en verwerving van FFPE-blokken die specifieke indicaties vertegenwoordigen? Kijk op onze histologie resource pagina. Lab-Ally is een industrieleider op het gebied van 45CFR46 en 21CFR11 naleving, ethisch verkregen menselijke biospecimens, bioinformatica, wetenschappelijk gegevensbeheer en meer.

1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Formaldehyde Fixatie. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Changes in Differential Gene Expression because of Warm Ischemia Time of Radical Prostatectomy Specimens. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
3. Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Tissue Handling and Specimen Preparation in Surgical Pathology: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
4. Kiernan, J. A. (2000). Formaldehyde, formaline, paraformaldehyde en glutaraldehyde: Wat ze zijn en wat ze doen. Microscopy Today, 00(1), 8-12. Opgehaald van http://publish.uwo.ca/~jkiernan/formglut.htm.
5. Pizzolato, P. (1976). Formalinepigment (zure hematine) en verwante pigmenten. American Journal of Medical Technology, 42(11), 436-440.
6. Howat, W. J., & Wilson, B. A. (2014). Weefselfixatie en het effect van moleculaire fixatieven op downstream kleuringsprocedures. Methods, 70(1), 12-19.
7. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., & Ranganathan, K. (2012). Chemische en fysische basisprincipes van routine formaldehyde fixatie. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology : JOMFP, 16(3), 400-405. http://doi.org/10.4103/0973-029X.102496
8. Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961-1971.
9. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., & Bouzyk, M. M. (2009). DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. http://doi.org/10.1101/pdb.prot5138
10. Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Opgehaald van http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed Dec 28, 2016