Deoxynucleotidetrifosfaten (dNTP’s) zijn de essentiële bouwstenen van nucleïnezuurmoleculen en zijn als zodanig noodzakelijke bestanddelen van PCR-mengsels, aangezien zonder deze bestanddelen geen nieuw (geamplificeerd) DNA kan worden gegenereerd. De vier afzonderlijke deoxynucleotiden die samen een DNA-sequentie vormen (d.w.z. desoxyadenosinetrifosfaat, dATP; desoxythymidinetrifosfaat, dTTP; desoxycytosinetrifosfaat, dCTP; en desoxyguanosinetrifosfaat, dGTP) worden gewoonlijk in equimolaire hoeveelheden aan PCR- en RT-PCR-mixen toegevoegd, hoewel, indien de DNA-doelsequentie die met PCR moet worden geamplificeerd hoofdzakelijk uit dATP/dTTP (AT-verhouding) of hoofdzakelijk uit dGTP/dCTP (GC-verhouding) bestaat, de molaire verhouding van de aan het PCR-mengsel toegevoegde dNTP’s kan worden gewijzigd om met deze onevenwichtigheid rekening te houden. DNTP’s worden meestal afzonderlijk of als (equimolair) mengsel gekocht bij commerciële leveranciers (bv. Roche, Promega, enz.), en zijn chemisch stabiel wanneer zij in licht alkalische waterige oplossingen bij -20 °C worden bewaard. Er zij echter op gewezen dat dNTP’s in oplossing van nature zuur zijn; vandaar dat werk- en voorraadoplossingen eventueel met alkalische verbindingen moeten worden geneutraliseerd voordat zij op lange termijn worden opgeslagen. Geneutraliseerde dNTP-oplossingen worden gewoonlijk aangepast tot 10 mM stockoplossingen door spectrofotometrie, of door het juiste volume steriel water aan het gevriesdroogde product toe te voegen direct na de chemische synthese. Sommige PCR’s kunnen baat hebben bij het gebruik van sterk gezuiverde dNTP’s van “PCR-kwaliteit” (Roche) die minder dan 0,9% deoxynucleotide-difosfaten (dNDP) bevatten, >99% zuiver zijn en vrij van verontreinigingen zoals gemodificeerde nucleotiden en tetrapyrofosfaat. Deze (duurdere) dNTP’s met een hoge zuiverheid kunnen nuttig zijn bij het succesvol amplificeren van PCR-DNA uit preparaten die zeer lage aantallen doel-DNA-kopieën bevatten.
In sommige PCR-toepassingen en -protocollen kan één van de vier dNTP’s worden vervangen door een analoog, dNTP, b.v. inosine, 7-deaza-2′ -deoxyguanosine, of een gemodificeerd dNTP, b.v. een biotine-, fluorofoor- of radioactief gelabeld dNTP. Dergelijke modificaties maken verdere downstream-post-PCR-verwerkingstoepassingen mogelijk.