De ziekte van Albers-Schönberg (autosomaal dominante osteopetrosis, type II) is het gevolg van mutaties in het ClCN7-chloridekanaalgen

Abstract

De ziekte van Albers-Schönberg, of autosomaal dominante osteopetrose, type II (ADO II), is de meest voorkomende vorm van osteopetrose, een groep aandoeningen die wordt gekenmerkt door een verhoogde skeletmassa als gevolg van een gestoorde bot- en kraakbeenresorptie. Na de toewijzing van het gen dat ADO II veroorzaakt aan chromosoom 16p13.3, melden wij nu zeven verschillende mutaties in het gen dat codeert voor het ClCN7-chloridekanaal in alle 12 geanalyseerde ADO II-families. Bovendien werd een patiënt met de ernstige, autosomaal recessieve, infantiele vorm van osteopetrosis (ARO) geïdentificeerd als homozygoot voor een ClCN7-mutatie. Uit genotype-fenotype correlaties blijkt dat ADO II een dominant negatief effect vertoont, terwijl verlies-van-functie mutaties in ClCN7 geen afwijkingen veroorzaken bij heterozygote individuen. Omdat sommige ARO-patiënten mutaties hebben in beide exemplaren van het ClCN7-gen, is ADO II allelisch bij een subset van ARO-gevallen.

Ontvangen op 2 oktober 2001; herzien en geaccepteerd op 11 oktober 2001.

INLEIDING

In gezondheid is de remodellering van het beenderweefsel het resultaat van de evenwichtige processen van botvorming en botresorptie. Overmatige resorptie veroorzaakt osteoporose, de oorzaak van de meeste niet-traumatische botbreuken (1). Omgekeerd veroorzaakt gebrekkige botresorptie osteopetrose, gekenmerkt door dichte maar meestal broze botten. Bij de mens zijn ten minste acht vormen van osteopetrose beschreven (2). Deficiëntie van het isoenzym koolzuuranhydrase II veroorzaakt autosomaal recessieve osteopetrose (ARO) met niertubulaire acidose en cerebrale calcificaties (3; MIM 259730), terwijl de meerderheid van de gevallen van maligne ARO (4; MIM 259700) het gevolg zijn van mutaties in het TCIRG1-gen (5,6). Sommige zeldzame gevallen van osteopetrose, blijkbaar met een autosomaal recessieve wijze van overerving, vertonen een milder fenotype en worden daarom de “intermediaire” vorm genoemd (7,8; MIM 259710).

Autosomaal dominante osteopetrose (ADO) komt veel vaker voor dan zijn recessieve tegenhangers (9). Echter, vanwege het relatief goedaardige klinische beeld, waarbij veel patiënten asymptomatisch zijn en alleen worden ontdekt door toevallig radiografisch onderzoek, wordt de prevalentie van ADO onderschat. Bij families met ADO worden over het algemeen twee subtypes gerapporteerd, voornamelijk gebaseerd op radiografische kenmerken (10,11). Type I (ADOI) vertoont een gegeneraliseerde, diffuse osteosclerose die vooral het schedelgewelf aantast (11). Type II (ADO II; MIM 166600), de vorm die oorspronkelijk in 1904 werd beschreven door Albers-Schönberg (12), is de meest voorkomende vorm met een geschatte prevalentie van maximaal 5,5/100 000 (13). Klinische verschijnselen zijn onder meer niet-traumatische fracturen, vooral van lange beenderen, hersenzenuwverlammingen, artrose van de heup en mandibulaire osteomyelitis (14). Röntgenologisch manifesteert ADO II zich met een segmentaire osteosclerose, overwegend aan de werveluiteinden (“ruggerstrui wervelkolom”), iliacale vleugels (“bot in bot” teken) en schedelbasis (9) (Fig. 1).

Onlangs leidde een genoombrede zoektocht ons tot de toewijzing van een gen dat ten grondslag ligt aan ADO II aan chromosoom 16p13.3 (15). Interessant is dat het gen dat codeert voor het ClCN7-chloridekanaal zich binnen het kandidaatgebied van 8,4 cM bevindt (16). In feite is het chloridekanaal essentieel voor de verzuring van de extracellulaire resorptielacune die nodig is voor de osteoclast-gemedieerde afbraak van botweefsel (17), en is gemuteerd in één patiënt met ARO (17). Daarom beschouwden wij ClCN7 zowel als een positioneel en functioneel kandidaat-gen voor het veroorzaken van de ziekte van Albers-Schönberg.

RESULTATEN

Mutatie-analyse van ADO II families

Omdat de genomische sequentie inclusief het ClCN7 gen beschikbaar is uit sequentie-databases (GenBank toetredingsnos AL031600 en AL031705), is mutatie-analyse van de exonen en intron-exon grenzen mogelijk met behulp van genomisch DNA. Hierbij kwamen zeven verschillende mutaties in ClCN7 (Fig. 2) aan het licht in 12 niet-verwante ADO II families (Tabel 1). Vijf mutaties zijn missense, één resulteert in een deletie van één aminozuur en één delet twee nucleotiden waardoor een frameshift ontstaat die het C-terminale einde van het eiwit beïnvloedt. Geen van deze mutaties werd in 100 controlechromosomen gevonden.

Vier mutaties zijn redundante mutaties. De 2423delAG-mutatie werd geïdentificeerd in een familie uit Frankrijk en in een Amerikaanse familie. De G215R-mutatie kwam voor in een Franse, een Deense en een Amerikaanse familie. De P249L-mutatie werd aangetroffen in een Franse en in een Duitse familie. Ten slotte werd de R767W-mutatie vastgesteld in een Franse en een Amerikaanse familie (tabel 1). De verschillende geografische oorsprong van de bestudeerde families, alsmede de analyse van microsatellietmerkers die het ClCN7-gen flankeren (gegevens niet weergegeven), wijzen erop dat het hier om onafhankelijke mutaties gaat, d.w.z. dat zij niet van een gemeenschappelijke voorouder zijn geërfd.

Mutatie analyse van een ARO patient

Linkage analyse met markers van chromosoom 16p13.3 toonde duidelijk homozygositeit voor alle markers bij een ARO patient geboren uit consanguine, gezonde ouders (gegevens niet getoond). Daarom werd mutatie-analyse van ClCN7 uitgevoerd, waarbij een homozygote missense mutatie op positie 766 (L766P) werd aangetoond (Fig. 2). Beide ouders zijn heterozygoot voor deze mutatie.

Positie en behoud van gemuteerde aminozuren

De transmembraantopologie voorgesteld voor de ClC chloride kanalen suggereert 10-12 transmembraandomeinen (18). De vijf aminozuren die betrokken zijn bij de missense ADO II mutaties, evenals de mutatie die betrokken is bij de ARO patiënt, zijn alle zeer goed geconserveerd onder de verschillende leden van de ClC chloride kanaal gen familie (Fig. 3). De G215R en P249L mutaties zijn recurrente mutaties die gevonden werden in de patiënten van respectievelijk drie en twee niet-verwante families (Tabel 1). G215 is een zeer geconserveerd residu gelegen tussen D2 en D3 (Fig. 4), een gebied waarvan bekend is dat het de porie-eigenschappen van het kanaal beïnvloedt (19), terwijl P249 deel uitmaakt van een zeer geconserveerd, structureel element dat een substantieel deel van de porie van het ClC kanaal vormt (20). R286 bevindt zich in de extracellulaire ruimte, net buiten het transmembraandomein D5. Dit aminozuur is geconserveerd tussen de verschillende ClC eiwitten, met uitzondering van ClC1 en ClC2 die een afwijkende sequentie hebben in dit gebied van het eiwit. De twee resterende ADO II-mutaties en de ARO-mutatie bevinden zich in het cytosolische, C-terminale deel van het eiwit, waarbij naburige aminozuren betrokken zijn. G765, L766 en R767 bevinden zich binnen de D13-strook, die samenvalt met het tweede CBS-domein (cystathionine-β-synthase) dat in het CLCN7-eiwit is beschreven (21). Alle drie de mutaties lokaliseren binnen de β2-streng van het CBS-domein waarin mutaties zijn gerapporteerd die bij de mens ziekte veroorzaken (22). De precieze functie van dit domein is nog onduidelijk, maar een rol in eiwitsortering is gesuggereerd (21).

Tenslotte betreffen de twee kleine deleties aminozuren uit het intracellulaire C-terminale deel van ClCN7. Aminozuur L688, verwijderd bij één patiënt, bevindt zich tussen de twee CBS-domeinen, terwijl de verwijdering van twee nucleotiden, beginnend bij nucleotidepositie 2423, in twee niet-verwante families resulteert in een eiwit dat slechts in de laatste 10 aminozuren verschilt van wild-type ClCN7.

DISCUSSION

Osteopetroses bij zoogdieren vormen een heterogene groep van aandoeningen, waaronder ten minste acht verschillende klinische entiteiten bij de mens (2) en ongeveer negen spontane dierlijke mutanten (23). Bovendien veroorzaken knock-out muismodellen voor verschillende genen osteopetrotische fenotypes, wat de diversiteit illustreert van factoren die betrokken zijn bij de differentiatie en activering van osteoclasten (23).

Onlangs werd de heterogeniteit voor menselijke osteopetroses onderstreept door genetische heterogeniteit, zelfs binnen het ADO II-subtype (24,25). Deze onthulling was gebaseerd op een linkage studie met een uitgebreide Deense familie, die het ADO II gen toekende aan chromosoom 1p21 (26). Deze toewijzing werd echter niet bevestigd in studies van andere ADO II-families. In onze recente koppelingsstudie, die zes ADO II-families omvatte, lokaliseerden we het ziektegen op chromosoom 16p13.3 en vonden we in dezelfde Deense familie cosegregatie tussen ADO II en een chromosoom 16p13.3 haplotype (15). Daarom speculeerden wij dat het bewijs voor linkage aan chromosoom 1p21 in deze familie incidentele cosegregatie weerspiegelde. In de huidige studie hebben wij deze hypothese bevestigd door de identificatie van een ziekte-veroorzakende mutatie (G215R) in het ClCN7 gen in deze Deense familie. Dit, en het feit dat mutaties in dit gen werden gevonden in alle 12 geanalyseerde ADO II families, suggereert dat ADO II genetisch homogeen is.

Onze resultaten illustreren ook dat ADO II allelisch is met een subset van patiënten met de ernstige, autosomaal recessieve, infantiele vorm van osteopetrosis. Eerder werd één ARO-patiënt beschreven als een samengestelde heterozygoot voor een nonsense mutatie (Q555X) en een missense mutatie (R762Q) in het ClCN7-gen (17). We vinden nu een homozygote mutatie (L766P) in een andere ARO patiënt.

Figuur 5 illustreert onze correlatie tussen de verschillende genotypes en fenotypes. Zoals aangetoond door het fenotype van de ClC-7 knockout muis, veroorzaakt volledig verlies van functie van het ClC-7 chloridekanaal ernstige osteopetrose zoals gezien in ARO patiënten. Omdat ClCN7 mutaties tot nu toe in slechts twee ARO patiënten zijn gekarakteriseerd, is het onmogelijk om te weten of eventuele fenotypische verschillen de aard van hun mutaties weerspiegelen. Sommige zeldzame gevallen van osteopetrosis hebben een ’tussenvorm’. In deze gevallen wordt een autosomaal recessieve wijze van overerving voorgesteld, maar het fenotype is milder dan bij ARO (7,8). Misschien zijn deze gevallen te wijten aan combinaties van twee mutaties in ClCN7 die elk slechts in geringe mate de capaciteit voor Cl-geleiding verminderen.

De hier gerapporteerde ADO II mutaties zijn voornamelijk missense mutaties waarbij geconserveerde aminozuren betrokken zijn (Figs 3 en 4). De twee resterende mutaties zijn kleine deleties die ook de belangrijkste anatomie van het chloridekanaal behouden, en daarom hoogstwaarschijnlijk resulteren in effecten vergelijkbaar met de missense mutaties. Omdat chloride kanalen lijken te zijn georganiseerd als multimeren, waarschijnlijk dimeren (27), schaden deze mutaties waarschijnlijk hun functie als gevolg van dominant negatieve effecten. Met dergelijke effecten zullen de meeste chloride kanalen niet functioneren, hetgeen de fenotypische afwijkingen verklaart.

In het algemeen zijn de ouders van ARO patiënten fenotypisch normaal. Wij nemen aan dat dit een weerspiegeling is van het feit dat haploinsufficiëntie voor dit gen hoogstwaarschijnlijk geen klinische complicaties of radiografische bevindingen veroorzaakt. In sommige gevallen kan dit ook te wijten zijn aan de verminderde penetrantie van ADO II. De ouders van de in deze studie gepresenteerde ARO-patiënt hebben geen klinische symptomen van ADO II, maar een radiografisch onderzoek was niet beschikbaar.

Het allelische karakter van ADO II en ARO wordt ondersteund in een verslag van een uitgebreide familie waarin ADO II segregeert en waarin één individu ARO manifesteerde (28). Misschien veroorzaakt in deze familie een gemuteerd ClCN7 gen met een dominant negatief effect ADO II dat dan samenvalt met een de novo mutatie, of een mutatie geërfd van de tweede ouder die ARO veroorzaakt. De voorgestelde verklaring voor zowel dominante als recessieve vormen van osteopetrose geassocieerd met ClCN7-mutaties loopt gelijk met mutaties in het ClC-1-gen die myotonie veroorzaken. Mutaties die resulteren in het verlies van ClC-1 veroorzaken de autosomale, recessieve vorm (Becker type) (29) terwijl missense mutaties zich manifesteren met de minder ernstige, autosomaal dominante vorm (Thomsen type) (30).

Concluderend tonen wij aan dat de meeste, zo niet alle, gevallen van ADO II worden veroorzaakt door mutaties in het ClCN7 gen. Op basis van de aard van de ClCN7-mutaties is het ADO II-fenotype waarschijnlijk het gevolg van een dominant negatief effect. Onze bevindingen ondersteunen de hypothese dat chloride kanalen in het algemeen als homomultimeren optreden. Bovendien illustreert onze studie het allelische karakter van ADO II en een subset van ARO gevallen.

MATERIALEN EN METHODEN

Families en patiënten

Families A-F werden eerder beschreven omdat ze werden gebruikt om het gen voor de ziekte van Albers-Schönberg op chromosoom 16p13.3 te lokaliseren (15). Monsters G-L zijn van aangedane individuen uit families met een geschiedenis van de ziekte van Albers-Schönberg en verschillende zijn ook beschreven (31-33) (tabel 1).

Familie M woont in de Verenigde Staten maar is van Chinese afkomst. De proposita is het kind van een gezond echtpaar en werd geboren na een voldragen zwangerschap. De ouders zijn achterneven. ARO werd gediagnosticeerd op de leeftijd van 3 maanden toen zij zich in het New York Hospital Medical Center van Queens meldde met Bell’s palsy. Radiografisch onderzoek van het skelet toonde ernstige osteopetrosis en verschillende niet verplaatste schuine fracturen. Ze had anemie, reticulocytose, hepatosplenomegalie en lichte atrofie van de oogzenuw. Het kind onderging een mismatched allogene mergtransplantatie maar overleed op de leeftijd van 18 maanden aan sepsis en respiratoir falen.

Mutatie-analyse

DNA werd geïsoleerd uit bloed door middel van standaard procedures. Intron primers (Tabel 2), die alle coderende exonen en intron-exon grenzen van ClCN7 amplificeren, werden ontworpen uit genoomsequenties (GenBank toetredingsnos AL031600 en AL031705). De 25 exonen werden geamplificeerd uit Genomisch DNA Taq-polymerase of met PCR enhancer systeem (Gibco BRL), met enhancer concentratie 1×. Voor alle amplificaties werden 30 cycli uitgevoerd bij een temperatuur als gespecificeerd in tabel 2.

De PCR-producten werden gezuiverd met Concert Rapid PCR purification system (Life Technologies) en direct gesequeneerd met de voor de amplificatie gebruikte primers, met behulp van Big-Dye terminator chemie (Perkin-Elmer) op een ABI 3100 geautomatiseerde sequencer. Amplificatie van exon 9 resulteerde in een fragment van variabele lengte omdat dit exon een tandem-herhaling volgt van een 50 bp sequentie met variabel kopiegetal. In onze reeks monsters varieerde het kopiegetal tussen vier en zeven herhalingen. Deze herhaling interfereert in sommige monsters ook met het sequencen van dit exon in voorwaartse richting.

Alle exonen waarin vermoedelijke mutaties werden gedetecteerd, werden in 100 controlechromosomen gesequeneerd zonder dat de mutaties werden gevonden.

ACKNOWLEDGEMENTS

Wij danken de patiënten en families, alsmede de clinici die materiaal hebben geleverd. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie (G.0404.00) van het ‘Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek’ (FWO) aan W.V.H. Dit onderzoek werd tevens ondersteund door subsidies van de ‘Société Française de Rhumatologie’ (SFR), het ‘Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris’ (FERCMHP) en het Shriners Hospital for Children (nr. 8540).