Citrobacter freundii fitness tijdens bloedbaaninfectie

Verzameling van Citrobacter BSI isolaten

Vergeleken met andere Gram-negatieve soorten die regelmatig BSI veroorzaken, is er beperkte informatie beschikbaar over de fysiologie van C. freundii binnen de gastheeromgeving. Om deze tekortkoming te verhelpen, verzamelden we eerst acht isolaten die behoren tot het C. freundii complex van patiënten met BSI binnen het University of Michigan Health System. Fylogenie op basis van ribosomaal RNA is in staat om drie groepen Citrobacter-soorten te onderscheiden, waarvan groep I ten minste acht soorten omvat en C. freundii23,24. Identificatie op basis van 16S rRNA-sequentie en massaspectrometrie biedt echter een beperkte fylogenetische resolutie binnen deze groep Citrobacter-soorten. Daarom werden de isolaten die in deze studie werden gebruikt, verder geëvalueerd met behulp van een multilocus sequentieanalyse-benadering. Van de acht verzamelde isolaten clusterden er zes nauw met gevestigde C. freundii stammen (Fig. 1) en hadden een gemiddelde nucleotide identiteit van >98% met de type stam ATCC 8090, wat boven de typisch geaccepteerde 95% cutoff voor isolaten van dezelfde soort ligt. Van de twee resterende isolaten was UMH17 het meest verwant aan de Citrobacter pasteurii typestam CIP 55.13 en UMH18 aan de Citrobacter werkmanii stammen.

C. freundii bacteremia

Voordat de fitheidseisen van Citrobacter tijdens BSI werden onderzocht, werd een murien model van bacteremie ontwikkeld op basis van eerder werk met andere enterische soorten25. Onder de Citrobacter BSI isolaten, werden de stammen UMH14 en UMH15 gekozen als kandidaten voor gebruik in deze studie. Isolaat UMH14 vertoonde een meer consistente dosisafhankelijke kolonisatie van de milt en de lever 24 uur na injectie in de staartader (Fig. S1) en werd geselecteerd voor verdere karakterisering. Het was ook nodig om het infectiemodel te testen op mogelijke kolonisatie-bottlenecks vooraleer de bijdrage van individuele C. freundii genen tot de fitness te beoordelen met behulp van een grote collectie transposon mutanten. Een spontane nalidixinezuur-resistente mutant van UMH14 (UMH14Nal) werd geïsoleerd en bij co-cultuur met de ouderstam in rijk medium werd een gelijkwaardige in vitro fitness vastgesteld (Fig. S2). Om te bepalen of een diverse populatie van mutanten in de bloedbaan kan worden vastgesteld zonder stochastisch verlies van individuele klonen, werden de UMH14Nal en UMH14 stammen in verschillende verhoudingen gemengd en bij muizen geïnoculeerd. Na 24 uur werden verhoudingen tot 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) getolereerd zonder spontaan verlies van de ondervertegenwoordigde stam in de milt (Fig. S2), wat aangeeft dat een enkele muis ten minste 10.000 unieke transposon mutanten kan huisvesten bij een totale dosis van 5 × 107 bacteriën met behulp van dit model.

Om Citrobacter fitness-genen in het bacteriemodel te identificeren, werden vijf pools van willekeurige transposon insertiemutanten die >44.000 unieke insertieplaatsen vertegenwoordigen, geïnjecteerd in muizen en bacteriën die de milt koloniseerden, werden na 24 uur teruggevonden (Fig. S3). De relatieve overvloed van individuele transposon mutanten in het inoculum en splenic uitgangen, zoals bepaald door high-throughput sequencing, werd gebruikt om genen die bijdragen aan bacteriële overleving in het model te identificeren. In totaal 177 transposon-verminkte genen gaven een significant verlies van fitness en negen genen werden geassocieerd met een verhoogde bacteriële fitness wanneer gemuteerd (fold-change ≥2.0, Adj. P < 0.05) (Data S1). Een tweede analyse met deze dataset geïdentificeerd 546 chromosomaal gecodeerde putatieve essentiële genen waarvoor het aantal leest in de input bevolking was significant lager dan verwacht op basis van de beschikbare TA-sites en de bibliotheek populatiegrootte (logFC <-5.17) (Data S2). Met behulp van dit model van opportunistische en systemische infectie, werd verwacht dat de meerderheid van de geïdentificeerde fitness factoren zou kern fysiologische processen vertegenwoordigen in plaats van prototypische virulentiefactoren (bijv. eiwittoxines of adhesines). De categorisatie van de 177 genen geassocieerd met significante fitheidsdefecten door Clusters van Orthologe Groepen (COG) weerspiegelde inderdaad de overheersing van metabolische routes en cellulaire onderhoudsfuncties vereist tijdens C. freundii bacteriëmie (Fig. 2). Ongeveer de helft van de geïdentificeerde fitnessgenen past globaal binnen vijf COG-categorieën die energieproductie, aminozuurmetabolisme, DNA-replicatie en -herstel, translatie, en celwand- en membraanbiogenese omvatten.

Validatie van individuele fitnessgenmutanten

De bijdrage van individuele genproducten aan de fitness van C. freundii werd bevestigd met onafhankelijke deletie-insertiemutaties die in geselecteerde UMH14-genen werden geconstrueerd (tabel 1). Alle gemanipuleerde stammen die hier gerapporteerd worden, vertoonden geen grove replicatiedefecten zoals bepaald door groei in rijk medium (Fig. S4). Voor elk gen in tabel 1 werd de fitness gemeten door co-infectie van individuele mutanten met de UMH14 moederstam. Vijf van de zeven aanvankelijk geteste mutanten vertoonden een statistisch significant concurrentieel nadeel in milt of lever (Fig. 3A), wat de resultaten van de transposon screening bevestigt. De znuB mutant werd geselecteerd als een negatieve controle voor validatie hier, omdat de resultaten van de transposon scherm bleek dat er geen fitness defect werd geassocieerd met dit gen, ondanks bewijs van andere bacteriële soorten waaruit blijkt dat de bijdrage van de ZnuABC zinktransportsysteem aan murine infectie 26,27,28. In competitie met UMH14 vertoonde de znuB mutant geen significant fitness defect, in overeenstemming met de verwachte resultaten. De aangrenzende znuA (fold-change = 1.5, Adj. P = 0.527) en znuC (fold-change = 2.0, Adj. P = 0.035) genen van UMH14 gaven ook geen fitness defect of een minimaal defect wanneer gemuteerd door transposon insertie (Data S1).

Mutatie van het tatC-gen, dat codeert voor een component van het twin-arginine translocatiesysteem, leidde tot het grootste verlies van fitheid van alle geteste mutanten (Fig. 3). Om te bepalen of de verminderde fitness van deze mutant door genetische complementatie kon worden hersteld, werd het plasmide pBBR1MCS-5 met het tatC open leesraam in de tatC-mutant ingebracht en werd de relatieve fitness van de resulterende stam getest. De tatC-mutant vertoonde aanvankelijk een 67-voudig fitnesstekort in de milt in competitie met de wild-type stam (Fig. 3A), terwijl de gecomplementeerde tatC-mutant slechts een tweevoudig fitnesstekort vertoonde onder dezelfde omstandigheden (Fig. 3B). Ook de complementaire tatC-mutant was in de lever niet significant overgeconcurreerd ten opzichte van UMH14. Van het ouderplasmide pBBR1MCS-5 is bekend dat het bij infectie zonder selectie stabiel blijft29 en bij in vitro-cultuur van de C. freundii tatC-mutant die pBBR1MCS-5 of het complementatieplasmide tatC+ bevatte, was er 24 uur lang geen merkbaar verlies van plasmide bij afwezigheid van selectie (Fig. S5). Samen bevestigen deze resultaten stevig de vereiste voor TatC functie tijdens Citrobacter bacteriëmie.

Behoud van fitnessgenen onder Citrobacter isolaten

In de loop van deze studie werd de volledige genoomsequentie van elk Citrobacter isolaat bepaald en het voorspelde proteoom van elke stam werd vergeleken met UMH14 als een referentie. Van de 4.666 voorspelde genproducten gecodeerd op het chromosoom UMH14, zijn er 3.742 geconserveerd met ≥95% identiteit tussen alle C. freundii isolaten in deze studie (Fig. 4A). Het aantal geconserveerde proteïnen (≥95% identiteit) tussen alle stammen daalt tot 2.545 wanneer de voorspelde proteomen van UMH17 en UMH18 worden opgenomen, consistent met de plaatsing van deze isolaten buiten de C. freundii tak door multilocus sequentieanalyse (Fig. 1). Behoud van UMH14 fitness factoren was ook hoog, met 145 van de voorspelde 177 eiwitten geconserveerd op ≥95% aminozuur identiteit tussen de acht bacteriemie stammen (Fig. 4B), met inbegrip van alle zeven van de oorspronkelijke fitness factoren die werden geselecteerd voor validatie (tabel 1 en Fig. 3). Door UMH17 en UMH18 buiten beschouwing te laten, steeg het aantal geconserveerde fitness factoren tot 162 (92%). Deze resultaten suggereren een overlevingsstrategie van Citrobacter tijdens bacteriëmie die grotendeels afhankelijk is van geconserveerde eiwitten binnen de soort. Interessant is dat weinig fitheidsfactoren volledig uniek (<30% identiteit) waren voor UMH14 binnen deze subset van stammen. Een opmerkelijk voorbeeld is een vermeend operon met drie genen (CUC46_23440-CUC46_23450) met waargenomen fitheidsdefecten die variëren van 6- tot 14-voudig. Alle drie open leesramen coderen voor hypothetische eiwitten en van deze drie wordt alleen van CUC46_23450 voorspeld dat het codeert voor een geconserveerd domein met een toegewezen functie (cd01713, fosfoadenosine-fosfosulfaatreductase).

DNA recombinatie en herstelpaden

Een van de doelen van deze studie was het identificeren van geconserveerde biologische paden waarbij meerdere bacteriëmische fitnessfactoren betrokken waren. De RecBCD en RuvABC enzymcomplexen die betrokken zijn bij DNA recombinatie en herstel vertegenwoordigen zo’n voorbeeld. Het RecBCD-enzym is actief op duplex DNA-uiteinden en is vereist voor de processen van homologe recombinatie en recombinationeel DNA-herstel. Verwant aan deze functies, vergemakkelijkt het RuvABC enzym de migratie en oplossing van de Holliday junction vertakkingen30,31. Transposon insertie in ofwel recB, recC, of recD resulteerde in een 6-8-voudige vermindering van de fitness en op dezelfde manier, verstoring van zowel ruvA en ruvC door transposon insertie resulteerde in een >30-voudig verlies van fitness (Data S1). Belangrijk is dat het ruvA fitness defect werd bevestigd door competitie infectie tegen de wild-type stam met behulp van een onafhankelijk geconstrueerde mutant (Fig. 3A). Binnen de twee multi-eiwit complexen, werd alleen RuvB niet geïdentificeerd als een significante fitness factor in onze dataset. Van beide eiwitcomplexen is bekend dat ze deelnemen aan het oplossen van vastgelopen of ingestorte DNA-replicatievorken die optreden tijdens normale chromosomale synthese30, hoewel, en dit is belangrijk, de ruvA-mutant tijdens snelle replicatie in een rijk medium vergelijkbaar groeide met de wild-type stam (Fig. S4). Het is verleidelijk om te speculeren dat bacteriële DNA-schade in de gastheeromgeving, mogelijk door immuuncel-gemedieerde productie van reactieve zuurstofspecies, ook kan bijdragen aan de behoefte aan deze complexen.

Het twin-arginine translocatiesysteem

Het twin-arginine translocatiesysteem functioneert in Gram-negatieve bacteriële soorten om gevouwen eiwitten via het cytoplasmamembraan uit te scheiden. De rol van TatC in dit geconserveerde multi-proteïnesysteem is de herkenning van secretiesignaalsequenties voor eiwitten die via deze route worden geëxporteerd. Nadat de significante impact van het TatC gen op de in vivo fitness van C. freundii was vastgesteld (Fig. 3), werd beredeneerd dat eiwitten gesecreteerd door het Tat systeem ook nodig zouden kunnen zijn voor fitness in het muismodel. Om mogelijke door Tat gesecreteerde eiwitten te identificeren, werd de N-terminale sequentie van elk van de 177 fitnessfactoren geanalyseerd met de TatP 1.0 voorspellingssoftware32. Twee genen, CUC46_16565 en CUC46_16060, werden geïdentificeerd als coderend voor Tat-afhankelijke signaalpeptiden die twee-argininemotieven bevatten. Het CUC46_16565-product is voor 94% aminozuuridentiek met het E. coli SufI-eiwit, inclusief 100% behoud van het dubbele-argininemotief en het hydrofobe gedeelte van het signaalpeptide33. Het C. freundii sufI-gen werd gemuteerd en de fitness werd beoordeeld in competitie met de UMH14-stam om te bepalen of een deel van het fitnessdeficit geassocieerd met het verlies van TatC kon worden toegeschreven aan de verstoring van de SufI-functie (Fig. 5A). De sufI-mutantstam werd inderdaad in de milt 7-voudig en in de lever 17-voudig weggeconcurreerd ten opzichte van de wild-type stam. Aangezien de fitnesskosten van de tatC-mutatie echter varieerden van het 67-voudige tot het 112-voudige in de competitie met wild-type bacteriën (Fig. 3), impliceren de relatief lage fitheidkosten van de sufI-mutatie dat bijkomende Tat-afhankelijke substraten ook kunnen bijdragen tot fitheid. Pogingen om Tat-afhankelijke secretie van SufI in C. freundii te bewerkstelligen waren niet succesvol vanwege toxiciteitsproblemen bij expressie van een C-terminaal FLAG epitiope-tagged SufI construct, met name in de tatC-mutantstam (gegevens niet aangetoond). SufI is echter gebruikt als een model Tat-gesecreteerd eiwit in tal van studies die het E. coli Tat-systeem karakteriseren.

De tweede potentiële Tat-geëmitteerde fitnessfactor die werd geïdentificeerd, gecodeerd door CUC496_16060, is een voorspeld proline aminopeptidase (PRK10879) dat tot de PepP-superfamilie behoort. Een mutantstam zonder het pepP-gen werd in de milt ongeveer 3-voudig en in de lever ongeveer 2-voudig weggeconcurreerd, maar het conditienadeel ten opzichte van het wild-type was statistisch niet significant (Fig. 5A). Desondanks werd de subcellulaire lokalisatie van PepP bepaald met behulp van een C-terminaal FLAG epitoop-getagd derivaat op een plasmide met meerdere kopieën (PepPFLAG). Onverwacht lage niveaus van PepPFLAG werden gedetecteerd in de tatC-mutant vergeleken met UMH14; het PepPFLAG fusie-eiwit werd echter voornamelijk gevonden in de cytoplasmatische fractie van beide geteste stammen (Fig. S6) en er werd geen bewijs verkregen voor Tat-afhankelijke subcellulaire lokalisatie van het PepP-eiwit. Samen met de resultaten van de sufI-mutant competitie infectie, ondersteunen deze gegevens verder de notie dat extra Tat-afhankelijke fitness factoren aanwezig zijn in C. freundii of dat het cumulatieve verlies van eiwit translocatie via het Tat-systeem zwaarder weegt dan het verlies van functie voor een enkel substraat.

Een van de heersende fenotypes geassocieerd met verlies van functie tat mutanten in verschillende soorten is een stoornis in de motiliteit34,35,36,37. C. freundii is een gevlagelleerde bacterie die in staat is tot zwemmende motiliteit in een zachte agar matrix. De C. freundii tatC mutant vertoonde een ongeveer 2-voudige vermindering van de zwemmende motiliteit in vergelijking met de wild-type stam en zwemmen motiliteit werd volledig hersteld door genetische complementatie in trans (Fig. 5B,C). Deze resultaten tonen duidelijk een gebrek aan beweeglijkheid aan bij afwezigheid van de TatC functie; echter, aangezien er nog steeds een laag niveau van zwemmen werd waargenomen bij de tatC mutant, is het waarschijnlijk dat er nog enige flagellaire functie behouden blijft. Met uitzondering van fliQ, suggereert het algemene gebrek aan flagella-geassocieerde fitnessgenen geïdentificeerd tijdens bacteriëmie dat het belang van tatC voor C. freundii fitness grotendeels onafhankelijk kan zijn van de flagella disfunctie waargenomen in deze stam.

Metabole fitnesspaden

Zoals eerder opgemerkt, werd van een aanzienlijk deel van de geïdentificeerde Citrobacter fitnessgenen voorspeld dat ze functioneerden in metabole paden (Fig. 2). Drie verschillende genen die componenten vertegenwoordigen van het centrale koolstofmetabolisme (pfkA), het fructose- en mannosemetabolisme (mtlD), en de biosynthese van aminozuren (cysE) werden gekozen voor verder onderzoek. Bacteriële biosynthese van cysteïne vindt plaats uit L-serine via het tussenproduct O-acetyl-L-serine (OAS). Deze eerste stap in de modelroute van E. coli wordt gekatalyseerd door het enzym CysE O-acetyltransferase en het verlies van cysE resulteert in een cysteïne auxotrofie38,39. Een C. freundii cysE mutant is eveneens niet in staat zich te vermenigvuldigen in een gedefinieerd medium zonder cysteïne (Fig. 6A), maar kan dichtheden bereiken die in de buurt van het normale liggen wanneer het medium met ofwel OAS (Fig. 6B) of cysteïne (Fig. 6C) werd aangevuld. Genetische complementatie van de cysE-mutatie resulteerde in een gedeeltelijk herstel van de groei bij afwezigheid van cysteïne. Interessant is dat het volledig ontbreken van groei voor cysE mutant bacteriën in afwezigheid van OAS of cysteïne in vitro in contrast staat met het gedeeltelijke fitness defect dat waargenomen werd tijdens infectie (Fig. 3A). Dit suggereert dat Citrobacter wellicht in staat is deze metabolieten uit de bloedbaan te verkrijgen, maar dat de verstoring van de biosynthese toch fitnesskosten met zich meebrengt.

Als onderdeel van ons onderzoek naar het gastheer-geassocieerde metabolisme van Citrobacter, werd het vermogen van deze bacterie om verschillende koolstofbronnen te gebruiken onderzocht. Het PfkA fosfofructokinase enzym van andere enterische soorten is uitgebreid gekarakteriseerd en vertegenwoordigt de eerste geëngageerde stap in de glycolyse, waarbij het de fosforylering van fructose-6-fosfaat tot fructose-1,6-bisfosfaat katalyseert. Voor UMH14 elimineerde de mutatie van pfkA het vermogen van deze stam om zich te vermenigvuldigen op glucose als enige koolstofbron (Fig. 6D), wat gedeeltelijk hersteld kon worden door pfkA op een multicopy plasmide aan te bieden. Dit totale verlies van glucosegebruik in vitro correleerde met een tweevoudige afname in fitness tijdens bacteriëmie (Fig. 3A). Aangezien glucose een overvloedige koolstofbron is in het serum van zoogdieren40, zijn deze resultaten consistent met een rol voor Citrobacter gebruik van glucose tijdens infectie, maar suggereren ook dat het metabole repertoire van Citrobacter het gebruik van alternatieve koolstof- en energiebronnen kan vergemakkelijken.

Een tweede enzymatische activiteit waarbij fructose-6-fosfaat betrokken is, werd ook onderzocht op bijdragen aan Citrobacter bacteriemie. Het mannitol-1-fosfaat-5-dehydrogenase-eiwit, MtlD, vergemakkelijkt de bidirectionele omzetting van mannitol-1-fosfaat en fructose-6-fosfaat met gebruikmaking van NAD+ of NADH als co-factor41,42. Meerdere enterische bacteriesoorten kunnen de suikeralcohol mannitol gebruiken als enige koolstofbron na transport via een hexitol fosfoenolpyruvaat-afhankelijk fosfotransferase systeem, wat resulteert in de intracellulaire accumulatie van mannitol-1-fosfaat43,44. Een mogelijke bestemming van mannitol-1-fosfaat is MtlD-afhankelijke oxidatie tot fructose-6-fosfaat en vervolgens doorsluizen naar de glycolytische route. De C. freundii mtlD mutant vertoonde een vijfvoudige daling in fitness in de muizenlever (Fig. 3A) en deze observatie zette aan tot experimenten om te bepalen of C. freundii in staat was dit type metabolisme in vitro uit te voeren. UMH14 en mtlD afgeleide stammen werden gekweekt in een gedefinieerd medium met mannitol en de resulterende groeicurven tonen aan dat wild-type bacteriën en de gecomplementeerde mutant in staat waren om te prolifereren onder deze omstandigheden, terwijl de mtlD stam dat niet kon (Fig. 6E). Zoals verwacht was de mtlD-mutant in staat zich tot bijna wild-type niveaus te vermenigvuldigen wanneer glucose als koolstofbron onder aerobe omstandigheden werd toegediend (Fig. 6F). Samen stellen deze resultaten zowel het vermogen van C. freundii vast om mannitol als enige koolstofbron te gebruiken als de vereiste voor mtlD in dit proces.

Gedeelde fitnessstrategieën tussen pathogenen in de bloedbaanomgeving

We hebben eerder de fitnessvereisten van een andere opportunistische ziekteverwekker, S. marcescens, beoordeeld met behulp van een soortgelijk muizenmodel van bacteriëmie. De resultaten van de S. marcescens studie omvatten de identificatie van 212 fitness genen met behulp van technieken vergelijkbaar met het huidige werk45. In een poging om te bepalen of deze soorten gemeenschappelijke paden delen voor fitness tijdens BSI, werden de voorspelde proteomen van beide soorten eerst vergeleken. Eiwitten werden beschouwd als homologen tussen C. freundii en S. marcescens als ze ≥70% aminozuuridentiteit deelden over ≥50% van de sequentie. In totaal werden 42 homologe eiwitten geïdentificeerd als significante fitness factoren in beide organismen (Tabel S1), waarbij een aantal uiteenlopende functies vertegenwoordigd zijn in deze lijst van gedeelde fitness factoren. Met name het RuvA eiwit, waarvan het verlies resulteerde in een >10-voudige afname in C. freundii fitness door competitie infectie (Fig. 3A), werd samen met RuvC geïdentificeerd als fitness factoren in S. marcescens. Deze resultaten ondersteunen verder de hypothese dat resolutie van Holliday junction complexen, mogelijk tijdens recombinationeel herstel van DNA schade, belangrijk is voor in vivo fitness van deze organismen. Het PfkA fosfofructokinase enzym werd ook geïdentificeerd als een fitness factor in beide soorten. Zoals waargenomen bij Citrobacter, is S. marcescens pfkA vereist voor het gebruik van glucose als enige koolstofbron, en was het verder vereist voor optimale bacteriële replicatie in hittegeïnactiveerd menselijk serum45. In beide organismen droeg pfkA bij tot de fitness in de milt, zoals bepaald door de transposon screen, maar interessant genoeg vertoonde de S. marcescens pfkA mutant ook een ongeveer 9-voudig verminderde fitness in de nier door competitie-infectie met de wild-type stam. In de loop van dit werk werd vastgesteld dat de wild-type C. freundii UMH14-stam een relatief slechte kolonisatie van de nier vertoonde in het BSI-model, maar van het pfkA-gen van Proteus mirabilis is aangetoond dat het bijdraagt tot de fitness in de nier na infectie van de urinewegen46. Samen tonen deze resultaten de haalbaarheid aan van het identificeren van geconserveerde fitness strategieën tussen organismen binnen een specifieke omgeving. Verder werk zal nodig zijn om te bepalen of deze genproducten ook nodig zijn in andere BSI-veroorzakende organismen en of deze geconserveerde fitheidspaden kunnen worden geëxploiteerd.