Op 4 december bezocht ik de Kliniek voor Speciale Kinderen in het hart van Pennsylvania Dutch country, waar een piepkleine staf meer dan 2000 patiënten met een verscheidenheid aan erfelijke ziektes verzorgt. In het bericht van vorige week werd een gezin beschreven waarin 5 van de 6 kinderen een epileptische stoornis hebben met autistische kenmerken. Het onderzoek naar dit syndroom in de afgelopen 15 jaar illustreert prachtig de evolutie van gen-ontdekkingsmethoden voordat sequencing ons in een nieuw technologisch tijdperk katapulteerde. (Waarschuwing: jargon in het vooruitzicht.)
CONNECTING PHENOTYPE TO GENOTYPE
Heden ten dage, om het gen achter een niet gediagnosticeerde aandoening bij een kind te identificeren, vergelijken onderzoekers de exoom (eiwit-coderend deel van een genoom) sequenties van ouders en mogelijk broers en zussen om oorzakelijke genvarianten (allelen) te identificeren. Het gaat snel.
In het pre-genoomtijdperk volgden onderzoekers een indirect traject om van fenotype tot genotype te komen:
– Vaststellen dat symptomen “in families voorkomen.”
– Vaststellen dat de aandoening vaker voorkomt bij eeneiige tweelingen dan bij broers en zussen van patiënten dan in de algemene bevolking.
– Identificeren van abnormale chromosomen bij mensen met de aandoening.
– Het gebruik van genoomwijde associatie studies (GWAS) om patronen van genetische variatie te identificeren (op sets van single-base sites genaamd single nucleotide polymorfismen, of SNPs) die een ziekte-veroorzakende variant zouden kunnen markeren.
– Het identificeren van het gen en het maken van een muismodel om behandelingen te testen.
Toen de Amish Zwitserland verlieten in de vroege jaren 1700 om te ontsnappen aan religieuze vervolging en zich vestigden in Pennsylvania, brachten ze een staalkaart van de Europese genenpool mee. Door zich onderling voort te planten werden mutaties versterkt en ontstonden er “autozygositeitsreeksen” in hun genomen – delen van chromosomen die op beide exemplaren dezelfde DNA-sequenties hebben. Auto-zygositeitsruns wijzen erop dat twee verwanten een reeks genvarianten hebben geërfd van een gemeenschappelijke voorouder, zoals achterneven en achterneven van een overgrootouder. Deze allelen, die “identiek door afstamming” (IDB) worden genoemd, zijn een krachtig hulpmiddel voor het ontdekken van genen als ze uitsluitend voorkomen bij mensen die dezelfde ziekte hebben.
De AMISH CONNECTIE
De jongen die ik in de kliniek ontmoette en 4 van zijn 5 broers en zussen hebben corticale dysplasie-focale epilepsie (CDFE) syndroom. Het is het gevolg van een enkele ontbrekende DNA base in een gen genaamd CNTNAP2.
Zoals vele verhalen over gen-ontdekking, begon de ontdekking dat mutaties in CNTNAP2 ten grondslag liggen aan een verscheidenheid van hersenaandoeningen – autisme, toevallen, schizofrenie, Tourette syndroom, en taalstoornissen – met verschillende draden. Laten we ons concentreren op het verband met autisme.
Zelfs de oudste genetische technieken tonen een erfelijke component van autisme aan. Eeneiige tweelingen hebben een veel grotere kans het te krijgen dan broers en zussen van een kind met autisme; het risico voor broers en zussen is 75 keer zo groot als voor de rest van de bevolking.
In 1998 gebruikte het International Molecular Genetic Study of Autism Consortium GWAS om 6 regio’s in het genoom te identificeren die overeenkwamen met mensen die autisme hebben – de topkandidaat bevond zich op de lange arm van het zevende grootste chromosoom, of “7q.”
In 1999 wezen onderzoekers op de betrokkenheid van CASPR2, een type eiwit dat neurexine wordt genoemd en dat, wanneer het abnormaal is, het verzenden van een zenuwimpuls verstoort. Neurexinen staan op één lijn met andere eiwitten, neuroliginen genaamd, om de synapsen te creëren die zich vormen wanneer een jong kind de wereld begint te verkennen, waarbij geheugen wordt geconsolideerd in leren.
In 2003 kwamen er meldingen van herschikte chromosomen die het gen dat codeert voor CASPR2, CNTNAP2, verstoren bij mensen met het syndroom van Gilles de la Tourette en in 2007 bij mensen met een verstandelijke handicap, ontwikkelingsachterstand, spraakstoornissen en hyperactiviteit, maar niet met Gilles de la Tourette. Deze verschillende aandoeningen zijn niet verrassend – de effecten variëren afhankelijk van waar in de hersenen de neurexineniveaus uit balans zijn.
In 2006 brachten onderzoekers van de Clinic For Special Children en het Translational Genomics Research Institute een mutatie in CNTNAP2 in verband met het CDFE-syndroom bij nauw verwante Amish-kinderen. De aanvallen beginnen ongeveer op de leeftijd dat autistische kenmerken zich beginnen af te tekenen – 14 tot 20 maanden.
Voordat de aanvallen beginnen, zijn de symptomen van CDFE subtiel: kleine motorische vertragingen, slechte diepe peesreflexen, en een iets te groot hoofd. Kinderen hebben moeite zich te concentreren, mensen na te doen, en bewegingen te plannen, zoals kruipen, kruipen en lopen. De aanvallen zijn frequent en hevig, en het begin ervan luidt het afnemen van vaardigheden in – taal, cognitief en sociaal. Na enkele jaren houden de aanvallen op, maar het intellect blijft in de kindertijd steken en het individu heeft levenslange verzorging nodig.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, en Holmes Morton, MD, van de kliniek en hun collega’s gebruikten 100.000-SNP microarray-apparaten om het DNA van vier kinderen met CDFE-syndroom uit drie Amish-families te analyseren. Zij vonden een autozygoot gebied van 7,1 miljoen basen lang op het verdachte gebied op 7q. (Tegenwoordig herkennen algoritmen snel autozygositeit in exoomsequenties.)
De 7,1 miljoen basen omvatten 83 genen, maar slechts een paar waren zinvol. Het team sequendeerde eerst een gen genaamd CENTG3, waarvan bekend is dat het andere hersenaandoeningen veroorzaakt. Maar de zieke kinderen hadden daar geen mutaties in.
Toen vond Dr. Puffenberger, de geneticus in het team, een kortere weg: hij merkte één SNP op in het midden van CENTG3 die heterozygoot was in twee kinderen (twee verschillende varianten), in plaats van homozygoot (dezelfde variant in beide chromosoomexemplaren), wat een eind markeerde aan de identiek-door-afstamming regio. “Door een recombinatiegebeurtenis in het midden van het gen kon Eric er een heleboel wegwerken om de mutatie te vinden. Het is een perfect voorbeeld van ’toeval begunstigt de voorbereide geest’,” vertelde Dr. Morton me. Die ontdekking verkleinde het interessante gebied op 7q tot 3,8 miljoen basen.
Het tweede kandidaat-gen, CNTNAP2, ligt op de grens van het interessante gebied. Elk kind miste een enkele base van beide kopieën van chromosoom 7 daar, en elke ouder had dezelfde mutatie, maar in slechts een kopie. Ze zijn dragers. Het was de eerste wet van Mendel aan het werk.
Het team had hun gen gevonden. Ze zochten verder in de gemeenschap, en onder 105 gezonde Amish mensen, waren vier dragers. Negen van 18 patiënten die partiële aanvallen hadden maar geen specifieke diagnose, uit 7 families, hadden het CDFE syndroom.
De aanvallen waren raadselachtig. “Eén mutatie kan verschillende soorten aanvallen veroorzaken. Vier kinderen in één familie reageren verschillend. Sommigen zijn erg gehandicapt, anderen niet erg aangedaan,” zei Dr. Morton. Drie kinderen werden geopereerd om de aanvallen te verlichten, maar de verlichting hield niet aan. De operaties leverden echter monsters van hersenweefsel op die de onderzoekers in staat stelden beter te beschrijven wat er mis ging.
De connectiviteit in de aanvalsgevoelige hersenen is een puinhoop. Grijze stof en witte stof grenzen vervagen, en sommige delen van de cerebrale cortex zijn verdikt. De neuronen zelf zijn niet helemaal goed. Ze zijn te rond, te dicht opeengepakt, met verwrongen dendritische bomen. Stippen op de neuronen wijzen op te veel kernen van glia, de ondersteunende cellen die het grootste deel van het zenuwstelsel uitmaken. Het onderzoeksrapport van 2006 was poëtisch en beschreef de amygdala, de zetel van emoties, in de epileptische hersenen als “excentrische microscopische eilanden van gedeeltelijk gerijpte neuronale voorlopers in strakke clusters” gehuld in glia run amok.
Het portret van de Amish epileptische hersenen was zinvol in het licht van het werk aan het neurexine-eiwit CASPR2 (wat staat voor contactin-geassocieerd eiwit-achtig 2). Het neurexine vormt een steiger op de knopen van Ranvier. De knooppunten zijn de blootgestelde plaatsen op een axon tussen kussens van myeline, het isolerende materiaal dat in feite de celmembranen van glia zijn die rond het neuron zijn gewikkeld als een pleister rond een vinger. Zenuwimpulsen hobbelen door de knooppunten en verzenden berichten snel genoeg om het leven in stand te houden.
De CASPR2-eiwitten in de Amish-kinderen zijn achtergebleven. Ze passeren niet de neuron celmembranen en duiken in het cytoplasma zoals ze zouden moeten, en als gevolg daarvan storten nabijgelegen kalium kanalen in. Deze kanalen zorgen er normaal voor dat kalium-ionen uit de zenuwcellen stromen wanneer een impuls passeert, waardoor deze wordt gereset. Dus zonder de neurexine steigers, kan het neuron zichzelf niet resetten. De transmissie stopt. En, op een of andere manier, beginnen de aanvallen. Ik denk niet dat het bekend is of de aanvallen de autistische kenmerken induceren of dat ze direct ontstaan – verdere genetische studies moeten dat uitwijzen.
EEN MOUSE MODEL
Daniel Geschwind, MD, PhD en professor in de neurologie aan de David Geffen School of Medicine van UCLA, werkte aan autisme-genen, en las het artikel uit 2006 in de New England Journal of Medicine. “Hij belde en zei: ‘Je hebt mijn gen gevonden!’ Een mooie samenwerking begon, en hij maakte een muis met de Amish mutatie,” zei Dr. Morton. Bij de muizen is het CNTNAP2-gen uitgeschakeld, en net als bij mensen hebben ze toevallen en autistische trekken.
“Een muis loopt gewoonlijk de hele kooi rond, normaal sociaal en kletsend. Deze muizen waren geen van beide,” legde Dr. Morton uit. De muizen vertoonden ook herhalend gedrag en hadden toevallen.
De hersenen van de gemuteerde muizen vertoonden een abnormaal connectiviteitspatroon dat doet denken aan het eerdere histologische werk. “De voorkant van de hersenen praat vooral met zichzelf. Het communiceert niet zo veel met andere delen van de hersenen en mist lange-afstandsverbindingen met de achterkant van de hersenen,” zei Dr. Geschwind. De groep had soortgelijke afwijkingen aangetoond in de hersenen van kinderen met autisme.
De opvallende gelijkenis tussen de Amish-kinderen en de muizen biedt een proeftuin voor geneesmiddelen. Risperidon, dat wordt voorgeschreven om repetitief gedrag bij kinderen te behandelen, had hetzelfde effect op de muizen, terwijl het ook hun vermogen om nesten te bouwen verbeterde. Maar het medicijn helpt kinderen niet om socialer te worden.
Een voor de hand liggende kandidaat-medicijn om sociale vaardigheden te verbeteren is het “liefdeshormoon” oxytocine. Het is overvloedig aanwezig in dezelfde hersenneuronen die rijk zijn aan CASPR2 eiwit. Kan te weinig oxytocine autistische trekken veroorzaken? De resultaten van het aanvullen van oxytocine zijn veelbelovend, zowel bij muizen als bij kinderen.
Dr. Geschwind en medewerkers ontdekten dat een neusspray met oxytocine “sociale tekorten drastisch verbetert” bij de muizen. Omdat niet-autistische muizen niet reageerden, lijkt het hormoon inderdaad een tekort te compenseren.
Amish boeren geven al oxytocine aan koeien om hun baarmoederspieren samen te trekken, en ik herinner me dat ik het kreeg om een vastgelopen bevalling op gang te brengen. Maar probeer dit niet thuis. Er zijn verschillende klinische proeven gaande met oxytocine of medicijnen die de activiteit ervan in de hersenen stimuleren om de socialisatie bij kinderen met autisme te verbeteren.
Autism Speaks financierde de eerste klinische proef met oxytocine in 2010, en het NIH sponsort een grotere lopende proef met oxytocine neusspray. Maar voor zover ik kan nagaan, werden patiënten ingeschreven op basis van klinische diagnoses volgens de DSM-IV – niet het meer specifieke criterium van genotype.
Hoewel het idee om oxytocine te proberen om de sociale symptomen bij autisme te verbeteren niet vereiste dat de onderliggende mutatie werd gekend, kan dergelijke informatie nauwkeurigheid toevoegen aan alle conclusies door het mechanisme te overwegen – wat kan leiden tot het ontwikkelen van andere behandelingen. In een andere post zal ik bekijken hoe genetische precisie Dr. Morton in staat heeft gesteld behandelingen te ontwikkelen voor bepaalde aangeboren stofwisselingsfouten die veel vaker voorkomen bij de Amish, maar die nog steeds bij iedereen op pasgeborenen worden gevonden.