Jak funguje iontoměničová chromatografie?

Iontově výměnná chromatografie (IEX) je technika, která se běžně používá při čištění biomolekul. Zahrnuje separaci molekul na základě jejich náboje.

Tato technika využívá interakce mezi nabitými molekulami ve vzorku a opačně nabitými molekulami ve stacionární fázi chromatografické matrice. Tento typ separace je obtížný při použití jiných technik, protože náboj je snadno manipulovatelný pH použitého pufru.

Jsou možné dva typy separace iontovou výměnou – kationtová a aniontová výměna. Při aniontové výměně je stacionární fáze kladně nabitá, zatímco při kationtové výměně je nabitá záporně.

Princip iontově výměnné chromatografie

IEX chromatografie se používá při separaci nabitých biomolekul. Jako kapalná fáze se používá surový vzorek obsahující nabité molekuly. Při průchodu chromatografickou kolonou se molekuly vážou na opačně nabitá místa ve stacionární fázi.

Molekuly separované na základě jejich náboje se eluují pomocí roztoku o různé iontové síle. Průchodem takového roztoku kolonou dochází k vysoce selektivní separaci molekul podle jejich různých nábojů.

Technika

Klíčové kroky v postupu iontově výměnné chromatografie jsou uvedeny níže:

• Na iontově výměnnou chromatografickou kolonu se vloží vzorek nečistého proteinu při určitém pH.
• Nabité proteiny se navážou na opačně nabité funkční skupiny v pryskyřici
• K eluci separovaných proteinů se použije gradient solí. Při nízkých koncentracích solí se eluují proteiny, které mají málo nabitých skupin, a při vyšších koncentracích solí se eluují proteiny s několika nabitými skupinami.
• Nežádoucí proteiny a nečistoty se odstraní promytím kolony.

K eluci jednotlivých proteinů lze také použít gradient pH na základě jejich izoelektrického bodu (pI), tj. bodu, při kterém aminokyseliny v proteinu nesou neutrální náboj, a tudíž nemigrují v elektrickém poli. Protože aminokyseliny jsou zwitterové iontové sloučeniny, obsahují skupiny s kladným i záporným nábojem. V závislosti na pH prostředí nesou bílkoviny kladný, záporný nebo nulový náboj. Při svém izoelektrickém bodě neinteragují s nabitými částmi v pryskyřici kolony, a proto jsou eluovány. K eluci proteinů z aniontové výměnné pryskyřice lze použít klesající gradient pH a k eluci proteinů z kationtové výměnné pryskyřice rostoucí gradient pH. Je to proto, že zvyšování pH pufru mobilní fáze způsobuje, že se protein stává méně protonizovaným (méně kladně nabitým), takže nemůže vytvořit iontovou interakci se záporně nabitou pryskyřicí, což umožňuje eluci. Naopak snížení pH mobilní fáze způsobí, že se molekula stane více protonizovanou (méně záporně nabitou_, což umožní její eluci.

Výběr pryskyřice v iontově výměnné chromatografii

Iontově výměnné pryskyřice mají kladně nebo záporně nabité funkční skupiny kovalentně spojené s pevnou matricí. Matrice jsou obvykle vyrobeny z celulózy, polystyrenu, agarózy a polyakrylamidu. Některé z faktorů ovlivňujících výběr pryskyřice jsou aniontový nebo kationtový výměník, průtoková rychlost, slabý nebo silný iontoměnič, velikost částic pryskyřice a vazebná kapacita. Stabilita proteinu, který vás zajímá, diktuje výběr aniontového nebo kationtového výměníku – pokud stabilita nevadí, lze použít kterýkoli z těchto výměníků.

Použití iontově výměnné chromatografie

Iontová výměna je nejrozšířenější chromatografickou metodou pro separaci a purifikaci nabitých biomolekul, jako jsou polypeptidy, proteiny, polynukleotidy a nukleové kyseliny. Její široká použitelnost, vysoká kapacita a jednoduchost a vysoké rozlišení jsou hlavními důvody jejího úspěchu jako separační metody. Iontově výměnná chromatografie se široce používá v několika průmyslových aplikacích, z nichž některé jsou následující:

• Separace a čištění krevních složek, jako je albumin, rekombinantní růstové faktory a enzymy.
• Biotechnologie – analytické aplikace, jako je kontrola kvality a monitorování procesu
• Potravinářský a klinický výzkum – ke studiu odrůd pšenice a korelace proteinurie s různými onemocněními ledvin.
• Fermentace – kationtové výměnné pryskyřice se používají k monitorování fermentačního procesu při výrobě ß-galaktosidázy.

Další čtení

• Všechen obsah chromatografie
• Přehled chromatografie
• Použití plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC-MS)
• Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
• Kapalinová chromatografie-.Aplikace hmotnostní spektrometrie (LC-MS)

Citace

Podrobněji se věnuje biologii a biochemii.