この研究では、組織での遺伝子発現を分析する際にRNA単離方法の違いが結果に影響すると仮定しています。 RNA抽出方法は、フェノール:クロロホルム抽出後アルコール沈殿を行う方法（TRIzol）、フェノール:クロロホルム抽出後固相抽出を行う方法（カラムベース：miRVana、miRNeasy）、アフィニティ樹脂を用いる/用いない固相分離（Norgen total, Isolate II）に大別される。 これらの方法は、主に長いmRNAの抽出のために開発され、すべてのRNAが等しく精製されることを前提に行われてきました。 さらに、特定のRNA抽出方法を選択するためには、品質、量、価格、使いやすさ（抽出までの時間）など、多くの考慮事項があります。 ここでは、RNAの抽出に使用される方法も、下流のアプリケーションで異なる方法と比較して結果が変動することを示すデータを提示し、したがって、もう一つの重要な検討事項となります。
この研究は、RNAサンプルの量と質、およびmiRNAと標的遺伝子の発現の分析において、RNA分離方法が異なることを実証しています。 私たちは、さまざまな理由からRNAの単離が困難な臓器を選びました。 例えば、脳からのRNA単離は、脂質が多いため収量が少ないことがしばしば指摘されています。 これは特にBioline Isolate II キットで顕著でした。 製造元のプロトコールでは、10 mg のラット/マウス脳から最大 5 μg の RNA を精製することが推奨されている。 しかし、miRNeasyハンドブックでは、同じ量の入力材料で脳から5～20μgのRNAを達成できるはずであると示唆されている。 製造元のウェブサイトでは、脂質が豊富な組織での問題点として、カラムの詰まりが挙げられ、サンプル量を減らすか、溶解バッファーの量を増やすことが推奨されています。 私たちの抽出は、プロトコルの推奨範囲内で行われました。 その後、TRIsure試薬（Bioline社のTRIzolに相当）を用いて予備抽出を行い、水相をクリーンアップするために、このキットを用いてカラムベースの分離を行うことを提案している。 この方法は、miRVanaやmiRNeasyのRNA抽出方法と同等であり、この組織ではより良い収量が得られるかもしれない。 さらに、RNAの品質は、組織死前および死後の生理的ストレスに対する組織特異的な反応と相関している。 肺や肝臓などの組織は、高レベルのヌクレアーゼによるRNAの分解が早く進みやすいため、RINが低く、28Sピークが小さいのが特徴です。 ヌクレアーゼを不活性化するために、組織は急速に凍結され、秤量された材料が抽出バッファに加えられるまで解凍されないようにされる。 組織の解凍は防いだが、動物の安楽死や臓器の摘出から急速凍結までの時間が、使用した分離キットにかかわらず、すべての肺サンプルで観察された全体的に低いRIN値や一部の分解産物の一因であると断定することはできない。 ヌクレアーゼを不活性化する別の方法として、RNAlater (ThermoFisher Scientific) などの RNA 安定化溶液を使用すると、凍結していない組織サンプルを後で処理することができます。 RNA の完全性を確保するのに役立つと思われるが、すべての RNA 分離手順に適合するわけではないので、ユーザーは抽出を行う前に特定のメソッドを確認する必要がある。 Bioanalyserの分析において、一部のサンプルで60秒後にピークが追加された場合、gDNAの混入が示唆されます。 一部のキットでは、カラムにDNase処理を行うことができますが、逆転写の段階でgDNAを除去することを強く推奨します。 私たちのメソッドにこのステップが含まれていることが、ノルゲン肺サンプルの mRNA 発現を分析する際に干渉がなかった理由かもしれませんが、Taqman miRNA アッセイプロトコルには gDNA の除去が含まれていないため、miRNA 発現分析に影響を与えました。 さらに、RNAサンプルの純度は、RIN > 7のサンプルはほとんどのダウンストリームアプリケーションで問題なく動作するはずですが、qPCRなどの酵素反応を伴うものは、ヌクレアーゼ、金属イオン、有機汚染物質によって阻害される可能性があるため、重要な要素となっています。 一般に、Bioline Isolate II RNA サンプルは 260/230 の比率が低く、汚染物質が性能低下の一因になっている可能性があります。 最後に、total RNA調製におけるmiRNAの濃縮度にも違いが認められました。 miRNAはRNAレパートリー全体のごく一部であるため、完全性解析からその寄与を判断することは困難な場合があります。 Qubit microRNAアッセイは、一般的な汚染物質が存在する場合でも、少量のsmall RNAを高い選択性で検出することができます。 miRVana と Norgen 抽出法では高い割合の miRNA が検出されましたが、Norgen total RNA プレパラートの完全性解析では、大きな RNA (mRNA, rRNA または tRNA) の分解または酸化に伴い小さな RNA 断片が検出されたり、肺サンプルの場合は DNA の混入により Qubit の結果が乱れたりして、過剰な mRNA 濃縮が行われている可能性があります。 したがって、RNAサンプルの量、質、純度は、特定のRNA抽出方法を選択する上で非常に重要な要素であり、目的の組織に対してこれらの方法を最適化する方法についてさらに研究を進めることで、これらを改善することができます。 例えば、miRNAのパネルは、異なる癌の表現型の分類、再発の予測、治療への反応の予測に使用することができます。 しかし、miRNAベースのバイオマーカーを発見し、臨床応用するためには、RNAの抽出方法について最適化・標準化し、矛盾した結果が出ないようにする必要があります。 例えば、Zhouら（2014）による63件の発表済み研究のメタアナリシスでは、オンコミRであるmiR-21の予後価値を評価する際に一貫性がなく、対照的な結果さえ出ていることがわかりました。 著者らは、不均一性を、サンプルのソース、検出方法および正規化方法の違いに起因するとしたが、RNAの抽出方法については言及しておらず、これも寄与することを示した。 さらに、組織特異的な生物学的機能を明らかにすることは、正常組織における治療作用や潜在的な標的外作用の特定に役立つ。 miRNAとmRNAの相互作用の検証は、主に細胞培養アッセイで行われており、内因性miRNAを人工的に操作することが必要です。 しかし、細胞培養操作（模倣品のトランスフェクションなど）で得られるレベルは、通常、生体内で観察される生理的なレベルではないため、適切な動物モデルで結果を再現することが重要です。 現在のところ、異なる抽出方法を用いたトータルRNAサンプルからのmiRNAおよび標的遺伝子の検出を直接比較した報告はない。 RNA抽出法はshort RNAとlong RNAの分離効率に違いがあるため、同じサンプルから両方を検出したい場合は、適切な方法を慎重に検討する必要があることを示しました。 しかし、RNAの分離に用いた方法によって抽出効率に差があることを示す報告もいくつか出てきている。 Kimら（2011）は、コンフルエンシーの違い（高密度対低密度）や培養皿から剥離した場合（付着性対浮遊性）のmiRNA発現の違いに関する結論が、実はTRIzol法を用いたRNA抽出効率の違いによって説明できることがわかり、Molecular Cell誌の論文を撤回させた。 彼らは、GC含量が低く、二次構造が安定したmiRNAは、当初発表したように細胞内で分解されるのではなく、抽出中に失われることを発見した . El-Khouryら（2016）の以前の結果では、TRIzol LS、miRNeasy血清/血漿、miRCURYバイオフルイド抽出キットを比較すると、細胞、血漿、尿/血漿由来エクソソームからのmiRNA回収に違いがあることが分かりました . 著者らは、miRCURYキットは高純度のRNAを単離したものの、miRNAの回収率は低く、TRIzolはPCR効率に影響を与える低純度のRNAを生成し、miRNeasyは低品質のRNAを生成したもののmiRNA検出には最も優れた性能を示したことを発見しています。 同様に、McAlexanderら（2013）は、血漿と脳脊髄液からのmiRNA抽出に違いがあることを発見しました。 彼らは、miRVana、miRCURY Cell and Plantキット、TRIzol LS抽出液を、担体としてグリコーゲンを使用した場合と使用しない場合で比較しました。miRVanaはグリコーゲンを使用した場合と使用しない場合で同程度でしたが、グリコーゲンなしのmiRCURYはmiRVanaよりわずかに低い回収率を示しています。 しかし、グリコーゲンはmiRCURYキットでのmiRNA回収率を大きく改善しましたが、TRIzol抽出での低収量とばらつきを悪化させました。 さらに、グリコーゲンを担体とするmiRCURY Cell and PlantキットとmiRCURY Biofluids、miRNeasy血清/血漿抽出法を比較したところ、miRCURY Biofluidsはスパイクインした外来mRNAの相対存在度が最も高く、この方法が特定の用途で優れていると結論付けました。 これらの研究を総合すると、抽出方法の違いによるRNA回収率の違いが浮き彫りになり、目的の細胞、組織、液体に合わせて最適化する必要性が示唆されました。 組織の固定や凍結の方法から始まり、材料の保管、RNA抽出方法、逆転写やqPCR増幅に使用する方法、その他のダウンストリームプラットフォームまで、様々なステップがあります。 本研究では、組織の瞬間凍結、-80℃での保存、抽出前の解凍の防止、miRNA発現解析に最も推奨される方法を用いることで、これらの変数のいくつかを制御することを試みた。 例えば、ユニバーサルプライマーではなく、配列特異的なRTプライマーを使用することで、特異的な産物の増幅に優れていることが示されている。 qPCRは、グローバルプロファイリングプラットフォームよりも感度と特異性が高いため、miRNAと標的の発現を解析するためのゴールドスタンダードと考えられている。 重要なことは、大規模なシーケンスベースのプラットフォームからプロファイリングされたmiRNAの数の多さよりも、得られた結果の品質が重要であるということです。 さらに、私たちはRNAサンプルのmiRNA濃縮の効果を比較しませんでしたが、これまでの報告では、特にグローバルなmiRNAプロファイリングプラットフォームでは、濃縮を避けるようアドバイスされています。 例えば、Redshawら(2013)は、total RNAと濃縮材料を比較した場合、short RNA濃縮手順によって相対的なmiRNAレベルが著しく減少することを発見し、特に濃縮手順によって、濃縮前のサンプルに存在するmiRNAのコピー数が最大25%減少し、この損失は異なるmiRNA配列によって異なることを発見しました。 したがって、total RNAとshort RNAから得られたmiRNAのデータは直接比較できない可能性があります。 さらに、大きなRNAはsmall RNAのキャリアーとして機能することが示唆されています。 各社のmiRNA濃縮法が組織からのより良い回収につながるかどうかは、まだ判断がつきません。 Bioline社では、miRNAの分離に別のキットを提案していますが、miRNA専用キットは同じ溶出液からshort RNAとlong RNAの両方を分離できないため、他の抽出方法と直接比較するためにIsolate II total RNA kitを使用しました。 miRNA特異的なキットでは、同じ溶出液からshort RNAとlong RNAの両方を分離することはできず、最初にmiRNA種を濃縮して分離し、その後long RNAを抽出することにより、2つの別々のフラクションを得ることができるのです。 Isolate IIは、miRVanaやmiRNeasyキットのようにsmall RNAの単離に最適化されているわけではありませんが、標的遺伝子の発現についても優れているとは言えませんでした。 特定のキット間で大きな差があることを考えると、研究者はより堅牢な抽出方法を選ぶべきだろう
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