The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complex involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiprotein complexes in spermat capacitation and ZP interaction

精子は受精部位（アンピュラ）に達すると卵子膜に融合するまで2つのバリアに侵入しなければならない。 一つは卵母細胞を取り囲むヒアルロン酸に富んだ卵丘細胞の層であり、もう一つは卵母細胞自体の細胞外マトリックスであるZPである（Hartmannら、1972年）。 精子形成期にZPとヒアルロン酸の両方の結合部位ができ、精子が精巣上体を通過する際に結合能を獲得するにもかかわらず、これらの細胞がそのような相互作用にうまく参加できるようになるには、女性の生殖管内にはっきりとした期間の滞在が必要である（Austin 1951, Chang 1951）。 精子がこの環境下で受ける集団的変化は「受精能獲得」と呼ばれ、精子は卵丘細胞複合体から生じるシグナルに反応し、先体外分泌のプロセスを完了し、卵丘細胞との融合に適した状態になることが可能になる。

ZPは、ZP1、ZP2、ZP3という一連の硫酸糖タンパク質からなり、ほとんどの哺乳類種で高度に保存されている（ただし、ヒトとブタの卵子ではZP4/Bという追加のリガンドが報告されている）（Wassarmanら1999、Lefievreら2002、Yonezawaら2012）。 一般に、ほとんどの種でこれらのリガンドが精子結合を支配していると考えられている（Reidら（2011）も参照）。 しかし、驚くべきことに、ZP内の主要な精子受容体の正体や、精子がこのマトリックスに付着するメカニズムについては、現在も様々なモデルが検討されている（Visconti & Florman (2010)も参照）。 同様に、ZP上の適切なリガンドを認識する対応する精子表面受容体の正体に関する調査もまた、決定的な答えを提供できていない。 実際、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ（GALT1）、アリルスルファターゼA（ARSA）、及び精子接着分子1（SPAM1）を含む有望な受容体タンパク質候補のマウスノックアウトの文献が増加しており、それぞれ完全不妊をもたらさない（Hessら、1996、浅野ら、1997、馬場ら、2002を参照されたい）。 むしろ、様々な程度の結合能力の低下が見られることから、このプロセスにはある程度の機能的冗長性があり、多くの精子タンパク質がZPの接着を媒介するために協調して作用している可能性がある。

ほとんどの真獣類では、精子の受精能は、複数の精子タンパク質のチロシンリン酸化に至るcAMP媒介経路の活性化によって開始されると考えられている（Visconti et al 1995a, 1995b, Leclerc et al 1996）。 分子シャペロンは、この一連のタンパク質の中で際立っており、HSP90AA1、HSP90B1およびHSPD1が、受精の結果としてチロシンリン酸化を示すことが明らかになったタンパク質である (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004)。 現在のモデルでは、受精の際にこれらのシャペロンがリン酸化されることで、ZP認識タンパク質が複合体に組み立てられ、受精に備えてこれらの複合体が精子表面に移動する際に、シャペロンが積極的に働くと考えられている (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008)。 この配偶子接着における間接的な役割に加えて、精子表面シャペロンは、配偶子結合の際に硫酸化糖脂質の認識を仲介する接着分子としての機能も持つとされている（Boulanger et al 1995, Mamelak & Lingwood 2001）。

最近では、もともと電子輸送系多酵素複合体の解析のために開発されたブルーネイティブPAGE（BN-PAGE）の技術（Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994）が、マウスやヒトの精子表面多量体複合体の評価に適応されるようになった（Dun et al.） この手法では、生物活性を保持したネイティブなタンパク質複合体を電気泳動で分離することができる。 ヒトおよびマウスの精子において、BN-PAGEと、可溶化した全精巣を用いたファーウエスタンブロッティングを並行して行うことにより、相同なZPに親和性を持ついくつかの一次多タンパク質複合体が明らかになった（Dunら、2011年、Redgroveら、2011年）。

このような複合体の1つは、CCT/TRiC複合体（CCT1-CCT8）のタンパク質成分からなることが報告されており、二重リング構造は分子シャペロンとして機能し、マルチタンパク質複合体形成の制御に重要な役割を果たす（Feldman et al.1999, Guenther et al.2002 ）。 共免疫沈降法、共局在化法、近接ライゲーション法などの推定的証拠により、ZP結合タンパク質2（ZPBP2）は成熟精子におけるCCT/TRiC複合体の最も有力なクライアントタンパク質の1つであることが判明した（Dun et al.2011, Redgrove et al.2011 ）。 元々、二次的なZP結合に関与していたが、より最近の研究では、ZPBP2欠損の雄マウスは不妊であり、ZP相互作用と侵入に欠陥があることが示されている（Lin et al.2007）。 マウスでは、特定のCCT/TRiC複合体サブユニットが精子受精時に精子表面に転座するという追加の証拠がある (Dun et al. 2011)。

精子表面で同定されZP相互作用の制御に関与するもう一つの顕著なシャペロンクラスはHSP70ファミリである (Naaby-Hansen et al. 2010)。 CCT/TRiC複合体と同様に、HSP70ファミリーのシャペロンは、膜貫通タンパク質輸送と安定なタンパク質複合体の組み立ての両方を促進する役割も十分に文書化されている（Mayer & Bukau 2005）。 HSP70ファミリーのメンバーのうち、精巣で排他的（マウス）または優勢（ヒト）な発現を示すものは、雄の生殖機能に必須であると思われる。 実際、このシャペロンであるHSPA2の異常発現は、ヒトにおける重度の男性因子不妊の表現型と相関しており、特に精子がin vitroで同種の卵子と相互作用する能力に影響を与えている（Eddy 1999, Huszarら 2007）。 マウスとヒトでは、HSPA2は精子形成に基本的な役割を担っており、前者ではこのタンパク質を標的として欠失させると、精子形成の早期停止とそれに伴う精子の欠落を引き起こす（Eddy 1999）。 ヒトでは、HSPA2の発現レベルは体外受精の成功率と正の相関があり（Huszar et al.

私たちの研究室でHSPA2の特性を調べたところ、このシャペロンはヒト精子の先体ドメインに存在し、少なくとも5つの高分子量タンパク質複合体の構成要素であることがわかりました (Redgrove et al. 2012)。 これらのデータと一致するように、我々はHSPA2複合体の中で最も優勢なものに、さらに2つのタンパク質が含まれていることを確認した。この2つのタンパク質は、以前に精子とゾナの相互作用に関与しているとされた（Redgrove et al.） さらに、Huszarらの発表した結果と一致して、孤立性病変を持つ男性の精子において、in vitroで同種卵子のZPと相互作用する能力がHSPA2レベルで著しく低下することを証明することができた（Redgroveら、2012年）。 現在、私たちは、精子形成の初期段階における精子結合部位の形成異常（Huszarら、2000年）、あるいは、HSPA2が、精子表面における精子受容体の集合や提示を促進するなどの莢膜形成中の精子表面の再構築に関与できないことによる精子接着の欠損に注目して研究を行っている。

精子表面複合体の組み立てに関する我々の研究に加えて、Hanらは独自に、マウスの精子表面における代替シャペロン搭載の多タンパク質複合体を同定している。 興味深いことに、上述のように、HSPA5、カルネキシン、内在性膜タンパク質2B、およびADAM7からなるこの複合体は、明らかに受精の際に組み立てられる（Han et al.） この複合体の機能はまだ完全に解明されていないが、ADAM7の発現は、精子のZPへの接着に重要な追加のADAMタンパク質、ADAM2およびADAM3（Kimら、2006）の存在に関連している（Muro & Okabe 2011）。 また、HSPA5は、女性の生殖管狭窄部における卵管上皮細胞（OEC）への高品質精子の接着促進に関与していることが知られている。 このリザーバーの形成は、卵母細胞が膨大な量に放出されるのに備えて精子を非静止状態に保つという意味で、生存促進効果があると考えられている（Topfer-Petersen et al.2002）。 興味深いことに、シャペロンであるHSPD1とHSPA5もウシOECの表面に局在しており、したがって精子とOECの結合に関与している（Boilardら、2004）。 これは、多タンパク質複合体の機能的な組み立てと提示のためのプラットフォームを提供する膜の特殊な領域である(Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011)。 シャペロン複合体のラフト環境への移行は、ヒト精子のHSPA2 (Nixon et al. 2011) やマウス精子のCCT/TRiC複合体成分 (Dun et al. 2011) でも観察されている。 これらの膜ドメインは、GALT1、ZP3R、SPAM1など、さらに多くの推定ZP受容体タンパク質を構成し、精子表面のリモデリングとZP結合における役割を強化している（図1；Nixonら、2009, Asanoら、2010)。 しかし、HSPA2はそのATPaseドメインを介して、精子の脂質ラフト内で同定された主要な糖タンパク質である3′sulfogalactosylglycerolipidに結合することが報告されている（Mamelak & Lingwood 2001）。

主要なシャペロン複合体およびZP受容体タンパク質の再配置における脂質ラフトの推定役割に加えて、ARSAおよびZP3Rなどの多くの推定ZP受容体が存在するという有力な証拠も存在する。 といくつかの分子シャペロンは、先体などの細胞内部位から精子表面へと受精能依存的に移動し、ZPとの相互作用に先立ち細胞を準備することを示す（Nixon et al. 2009). 先体外膜と精子形質膜の密接な接触は、相補的な可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体（SNARE）タンパク質の結合を介して行われ、先体内容物が完全に失われる前に精子表面への酵素の移動経路となる融合孔の形成につながることが提案されている（Søgaard et al.1994, Blas et al.2005, Tsai et al.2007). このモデルを支持するものとして、Brahmarajuら（2004）による研究では、VAMPとSNAPに対する抗体を先体小胞に投与すると、マウスにおける精子-ZP結合が阻害されることが示された

このように精子表面が徐々にプライミングされることから、先体外分泌のall or noneという性質に関する疑問が提起された。 それにもかかわらず、SNARE複合体の機能的なアセンブリは、先体内容物の完全な喪失を可能にする長時間の精子膜融合事象を支えるようにも見える（Tsaiら、2010）。 ほとんどの哺乳類種では、ZPとの接触により先体外分泌が開始されると広く信じられているが、マウスで行われた多くの研究により、ZPとの接触前に先体外分泌を開始した精子でも卵子と受精できることが実証されている（Nakanishi et al.1999、Jin et al.2011 ）。 この現象はモルモット（Huang et al. 1981）やハムスターの精子（Yanagimachi & Phillips 1984）にも当てはまると思われる。 このような知見は、先体反応の開始における卵丘の重要な役割を示唆し、先体反応の本質および実際にZP相互作用を正確に報告する、卵丘-卵丘ゾナ構造を用いて行われたin vitro研究の能力に関する懸念を提起するものである。

このような論争にもかかわらず、シャペロン様分子は、グルタミン含有SNARE (Q-SNARE) およびアルギニン含有SNARE (T-SNARE) の三元複合体への会合を促進する能力によって、先体外分泌にも関与している (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005)。 興味深いことに、ブタにおけるエレガントな研究により、受精の準備として、受精の際に精子細胞膜とアクロソーム外膜の安定したドッキングが引き起こされることが実証されている（Tsai et al.2010）。 Tsaiら（2012）による最近の研究では、一枚膜混合小胞の存在も証明された。この小胞は、他の重要な機能の中でも、精子表面での二次的なZP結合タンパク質の動員を可能にし、シンタキシン3、SNAP23、VAMP2、および追加のタンパク質、コンプレキシン2からなる新しい三量体のSNARE複合体を有している。 このような複合体の形成によって放出されるエネルギーは、精子の細胞膜と先体内膜を引き寄せることによって、膜融合を開始するために使われる（Tomes et al.） このプロセスが完了すると、受精の下流工程である卵膜結合と融合に関与する精子ドメインが露出することが重要となる

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