Positive functional synergy of structurally integrated artificial protein dimers assembled by Click chemistry

Click chemistry interface sites

私たちは、タンパク質の表面で会合性の高い部分は、相互に適合する非共有結合性相互作用を形成して統合構造を生成しやすいと推察しました。 タンパク質は単量体であるため、これらの相互作用はせいぜい弱く一過性のもので、持続することはありません。そこで、新しい相互作用を促進し安定化させるために、界面サイトの一部として分子の「ボルト」が必要であると考えました。 最初のステップは、ターゲットタンパク質の中から、本来相互作用する可能性のある領域を特定することです。 ClusPro 2.040 (cluspro.org)を使って、二量体構成候補を作成した。 出力されたsfGFPホモダイマーモデルは、RosettaDock41,42を用いて改良、分析、ランク付けされました（補足表1）。 最高ランクの配置を図1bに、次の4つの配置を補足図1に示す（下の決定された構造に最も近いモデルである；下図参照）。 一方のsfGFPの他方に対する異なる向きが観察されたが、ドッキングにより145-148、202-207および221-224残基が二量体界面に寄与していることが日常的に判明した。 2つのタンパク質を結合させるために、遺伝的にコードされたバイオorthgonalクリックケミストリーが使用されました（図1a）。 例えばジスルフィド結合と比較すると、潜在的な立体衝突を克服するための長い側鎖、架橋の安定性の向上、非対称（異なるモノマー上の異なる連結残基）およびヘテロ二量体を設計通りに1対1で生成する能力などのメリットがある（下表参照）。 H148とQ204は、二量体と思われる界面に位置することから選択した（図1bおよび補足図1）。 両残基は azF の組み込み時に低分子シクロオクチン付加物で容易に修飾されることが知られており34,46 、機能中心である sfGFP 発色団（CRO）の近くに位置している（図 1b）。 ゲルモビリティシフト解析により、二量体化が成功したことが明らかになった（図1c、d）。これは質量分析により確認された（補足図2）。 残基132は二量体界面にあるとは予測されていなかったが（図1bおよび補足1）、染料46からカーボンナノチューブ35、一本鎖DNA36まで、さまざまな歪んだアルキン付加物と相性が良いことが知られている。 したがって、この化合物は、タンパク質-タンパク質界面およびクリック反応の適合性を予測する我々の能力の良いテストとして機能します。 132 残基が表面に露出しているにもかかわらず、SCO を含むタンパク質と sfGFP132azF を用いて二量体生成物は観察されなかった（補足図 3）。これは、表面界面の適合性の重要性と、クリック化学適合部位の特定に役立つインシリコ解析の有用性を示している。 立体的な衝突や他の領域で長く続くタンパク質間相互作用のいずれかが、残基132での共有結合を妨げている可能性がある。

sfGFP148x2ダイマーの形成時に正の機能スイッチ

H148はCROとH結合を形成する（図）。 1b）、基底状態に存在する中性A型（λmax〜400nm、CRO A）とアニオンB型（λmax〜490nm、CRO B）47の集団を制御するプロトンシャトリングで重要な役割を果たす。 sfGFPではB型が優勢であるが、H148の代わりにazFを組み込むと（sfGFP148azF）、H結合が除去され、A型が優勢となる33,34 (Fig. 2a and Table 1)。 SCOを148残基に導入した場合（sfGFP148SCO）にも同様の効果があり、CRO Aが優勢になるが、マイナーなCRO Bの赤色シフト（λmax 492 nm）は小さくなる（図2a、表1）。 2

sfGFP148azF とsfGFP148SCOの二量化は二つの大きな正の効果を生み出す。 (i) CRO Bフォームの促進による〜490 nmでのスイッチオン蛍光、(ii) 490 nmでのモル吸光係数の増加による輝度の大幅な向上（図2aおよび表1）。 主要な励起ピークは、sfGFPWT (λmax 485 nm) と比較して、二量化により赤方偏移した (λmax 492 nm) (補足表 3)。 490:400 nmの吸光度比は、モノマーでは〜0.5、二量体では〜5と一桁シフトし、H148イミダゾール基の役割を代替できる種が明らかに存在しないにもかかわらず、CRO B形態が二量体の吸光スペクトルを支配した（図2a）。 sfGFP148azFを低分子化合物や光活性化で修飾した以前の例では、せいぜいCRO Bフォームへの部分的な変換が行われる程度であった33,34。 吸光度の 10 倍の変化は、蛍光発光にも反映され、490 nm で励起すると、いずれの単量体よりも 20 倍程度高い発光を示した（図 2a）。 さらに、この二量体は、元のスーパーフォールドであるsfGFPWTと比較しても、機能が向上していることがわかる（図2bおよび表1）。 モル吸光度および輝度はsfGFP148x2で約320%（1CROあたりでは約160%）増加し（図2b）、モノマーユニットが互いに独立して作用している場合、単純な相加的増加で予想されるよりも高い。 sfGFPH148C変異体は二量体化したが、Cu2+の存在下でのみ二量体化した(補足図4)。 スペクトル特性から、二量体はsfGFP148x2やsfGFPWTと比較して蛍光が弱いことが示唆された（補足図4）。 sfGFPH148C の二量化により、CRO A から CRO B への切り替えが観察されたが、二量体の CRO モル当たりの吸光度は sfGFPWT より低く、sfGFP148x2 より著しく低く、A 状態の大きな集団が依然として観察され た。 二量体sfGFPH148Cの490 nmでの励起による蛍光発光は、sfGFPWTの約半分であった。

sfGFP148x2の機能スイッチングの分子基盤

sfGFP148x2の結晶構造（統計情報は補足表2を参照）から、モノマーは2つのCRO中心を結ぶ長距離相互作用で広範囲な二量体インターフェースを形成していることが明らかになった。 sfGFP148x2のモノマーユニットは、互いに対して約45°ずれた準対称的なヘッド-テール配置をとっている（図3a）。 反平行なサイドバイサイドのモノマー配置は、最高位のモデルの配置に最も近い（補足図1および補足表1）。 新しいトリアゾール架橋の電子密度は明確に定義され（図3b）、細長い反1,4-トリアゾール結合を形成し、部分的に埋没して両方のモノマーユニットに密接に関連しているため、二量体界面の不可欠な部分を形成している（図3c）。 図3

この界面は天然の二量体48と類似の性質を持っている。 界面埋没面積は約1300Å2であり、各モノマーから概ね同じ残基が寄与している（図3c、d）。 H結合は重要な役割を果たしており、両モノマーからE142, N146, S147, N149, N170残基が8つのサブユニット間H結合に寄与している (Fig. 3b). この構造は、クリックリンクしたモノマーを用いることで、自然の二量体界面を模倣し、安定化できることを示している。当初のモデリングでは、クリックリンクは実現可能であるが、おそらく埋め込まれたリンクなしでは持続するには弱すぎるか、一時的であることが示唆されていた。

二量体化は一連の構造変化を引き起こし、長距離相互作用ネットワークを形成し、sfGFPがスイッチオンして明るさが増強されるメカニズムの根底をなす。 sfGFP148azF 構造 (PDB 5BT0) 34 は、148azF が sfGFPWT の H148 と同様の位置を占めているが、CRO B 状態の形成を促進する CRO フェノール OH 基への重要な H 結合から逃れることができないことを示している。 二量体化する際、148azFは同族モノマーの148SCOとトリアゾール結合を形成することにより、骨格と側鎖の位置が変化し、二量体中の水分子が占めることができる穴（図4aのW1azF）ができる。 この水は、CROazFと148azFの骨格のカルボニルにH結合することができる（図4）。 sfGFP148SCOモノマーユニットにも同等の水が存在し、（W1SCO）同様の相互作用を形成する。 これらの構造化された水分子は、H148の除去によって失われたH-結合相互作用を代替する可能性があり、基底状態におけるCRO Bの形成を促進することによって二量体を活性化する。 また、水分子は二量体界面に埋もれているため、バルク溶媒との動的交換は大幅に減少する。 さらに、2つのCROは、二量体界面にまたがる拡張した水のネットワークによって結合している（図4b, c）。 トンネル組成の分析から、各ユニット内の3つの水分子（W1azF/SCO, W2azF/SCO, W3azF/SCO）は対称であることがわかった。W4とF145SCOのバックボーンを組み合わせると、ダイマー界面を越えて2つの水ネットワークをつなぐ橋となった。 このように、二量体化により、拡張されたモノマー間の豊富な水結合ネットワークが生成され、A状態のCROからB形態への切り替えが促進される。

sfGFP148x2の1分子蛍光解析

全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いてsfGFP148x2二量体の蛍光挙動を1分子レベルで検討した。 単一 sfGFP148x2 二量体の蛍光強度の時間経過は、さまざまな強度状態を示し、80-100 カウントの蛍光が優勢で、より高い強度状態の亜集団よりも長寿命であり、これらは 100 から 300 カウントまでの強度の範囲に短時間移動することによって特徴付けられる (Fig. 2c) 。 また、蛍光の痕跡は、光退色までの時間が長く、光安定性が高いことも示している（図2cおよび補足図5）。 これに対し、sfGFPWTは光退色が速く、蛍光トレースは単一強度状態を示し、オン状態は一般に短時間で持続する（補足図6）。 さらに、単量体 sfGFPWT は、蛍光の開始とそれに続く光退色の前に、初期の暗い非蛍光の状態で存在することがわかった（補足図6）。 光退色と一時的な非蛍光状態（ブリンキング）の占有に先立つ連続した蛍光の平均「オンタイム」を抽出すると、sfGFP148x2はsfGFPWT（0.65秒）に比べて長い連続蛍光の時間（平均0.9秒）を示していることがわかった。 測定された1分子の蛍光強度の類似性を考えると、増加したオン時間および光退色寿命は、おそらくsfGFP148x2の定常状態アンサンブル測定で観察された蛍光の増加に寄与していると考えられる（図2a）。 単一の対数正規分布49を示すsfGFPWT（補足図6）とは異なり、sfGFP148x2は2成分適合を好んだ50（図2c）。 測定された強度分布は、低強度のピーク（約90カウント）と高強度のピークが部分的に重なっており、これは1分子蛍光トレースで観察される高強度状態への短時間の移動の結果である。 通常、2つの独立した活性を持つ蛍光体が共存する二量体では、それぞれの蛍光体が順次光退色する二峰性の強度分布が予想されるが、1分子の強度時間経過はこのモデルとは一致せず、2つの明確な状態がないことが示される。 sfGFPWTの単純なオン／オフ状態の挙動は、二量体の痕跡ではほとんど観察されず、それ自体、予想された2つの単量体の痕跡の付加物として示されず、より複雑な挙動を示す。

sfGFP204x2二量体形成時の機能向上

異なる連結部位がどのように機能的影響をもたらすかを調べるために、我々は上記の構築した代替二量体sfGFP204x2（図5a）を調べた（図1d）。 二量体化により、単量体またはsfGFPWTタンパク質を単純に加えた場合よりもスペクトル特性が向上することがわかり、二量体化の相乗効果が改めて強調された。 204 位に azF または SCO を導入しても、sfGFPWT 46 と比較して、スペクトル特性にはほとんど影響がなかった（図 5b および表 1）。 B CRO形態は、単量体において優勢であり、モル吸光度および発光強度の両方が、互いにおよびsfGFPWTと類似していた。 sfGFP204SCOの蛍光発光はわずかに減少していた（sfGFPWTの80%；表1）。 sfGFP204x2二量体を形成すると（証拠については、図1dおよび補足図2を参照）、スペクトル解析は、コアスペクトルパラメータ：モル吸光係数（ε）および蛍光発光の観点から機能強化を示した（図5bおよび表1）。 二量体化により、εは出発モノマーと比較して最大400%増加し、160,000 M-1 cm-1になった。 これは、CROあたりの平均モル吸光度が80,000 M-1 cm-1に相当し、出発モノマーと比較して輝度がほぼ2倍になり、sfGFPWTと比較して31,000 M-1 cm-1高くなることが確認された。 光吸収能の向上に伴い、蛍光発光も向上し、CROあたりの規格化発光はsfGFP204azFモノマーに比べ180%増加した。 Strickler-Berg51計算（ウェブサイト huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/ ）により、蛍光寿命はsfGFPWTの3.2 nsからsfGFP204x2の0.92 nsに低下した。 したがって、sfGFP148x2と同様に、二量体の構造では単量体に比べて電子励起と蛍光の出力確率が増加した（二量体のスペクトル比較は補図8を参照のこと）。 これは、sfGFPWTが緑色蛍光タンパク質の性能のベンチマークであるため、両方の二量体形態についてより印象的である。

The importance of symmetry to synergy

天然のタンパク質ホモダイマーは一般的に対称であり1，52、我々の人工ダイマーでも共通の架橋基によりこの対称性が模倣されていた。 我々は、構造的対称性の模倣としての共通の架橋残基が機能的相乗効果に重要であることを調べた。 このため、分離が困難な望ましくない生成物の生成を防ぐことができます。

2種類の組み合わせ（148SCO+204azFおよび148azF+204SOC）で148と204を結合した二量体を作製しました。 定常状態の蛍光から、両方の二量体において、CRO のプロトン化形態と脱プロトン化形態が明確に存在することがわかった (Fig. 6a, b)。 148azF-204SCO が結合した二量体は、A 型と B 型の相対的な集団に変化が見られ、490 nm のモル吸光係数が著しく増加した (Fig. 6a); これは元の sfGFP204SCO のほぼ 2 倍で、モノマーのスペクトルの単純加算で予測されるものより ~30% 高い値であった。 400 nmのピークの高さは、sfGFP148azFと148azF-204SCOが結合した二量体の両方で同じであり、二量体の脱プロトン化物の集団が元の単量体と同様であることが示唆された。 148SCO-204azFの組み合わせによる二量化では、プロトン化型と脱プロトン化型の相対的な集団が変化したが、400nmの吸光ピークの減少は、それに伴う490nmのピークの増加とは一致しなかった（図6b）。 実際、二量体化は、主要な吸光ピークのモル吸光係数がモノマーの単純な付加スペクトルよりも低く、大きく損なわれていた(Fig. 6b)。 非対称に結合した二量体は、対称に結合した二量体と比較して、蛍光性が低く、2つのCRO状態の混合集団を含むことは明らかであり、この場合、対称性が重要な機能的意味を持つことになる。

Heterodimer and functional integration

2種類のタンパク質からなる二量体は、一般的に見られる代替二量体の状態である1，2． また、機能的に異なるタンパク質が結合した新しい複合体を設計することも可能である。 生物学的直交結合の利点は、2つの異なるタンパク質ユニットからなる、定義された単一種の（ヘテロ）二量体を生成できることである（すなわち、A＋B＝A-Bであり、分離が困難なA-A、B-B、A-B混合物ではない）。 sfGFPのパートナータンパク質としては、スペクトルの重なり具合から、黄色蛍光タンパク質であるVenus29を選択した（補足図9）。 7599>

SfGFP148SCO を同等の azF を含む Venus (Venus148azF) と結合して GFVen148 を生成した（根拠は補足図11参照）。 新しいスペクトル特性が現れ、統合された系が生成されたことが示唆される。 GFVen148は、sfGFP148SCOやVenus148azFと比較して、輝度が向上した2量体を形成する（図7a、補足表3）。 興味深いことに、この二量体は、顕著なピーク幅の拡大もなく、個々の単量体の中間のスペクトル特性を有している（図7a、b、補足図12a）ことから、二つのCRO中心が蛍光発光の面で機能的に統合されていることが示唆された。 主要なλmaxは505nmであり、sfGFP（492nm）とVenus（517nm）の中間である。 B CRO 型（490-510 nm 領域）に相当するεは大幅に増加し（約 4-5 倍）、モノマーの単純加 算スペクトルより高く、A CRO 集団は減少するがまだ観察される（図 7a）。 これは、505 nmで励起すると、発光強度が約4倍増加することと一致する（Fig.7b）。 また、励起波長に関わらず、2つのモノマーの中間に位置する単一の発光ピークが観測された（517 nmのλEM；Fig. 7b, c）。490 nm（両方のCROを励起可能）の励起では、二重または広がったピークではなく、単一のピークが観測され、単一種の発光であることが示唆された。 独立に作用する2つのタンパク質を模擬した個々のモノマースペクトルの加算スペクトルは、測定されたGFVen148x2発光プロファイルと比較してより幅広く、赤方偏移したことから、新しい統合機能の考えを支持した（補足Fig.12b）。 また、Venus148azFはGFVen148と比較してこの波長での吸光度が低いため、400 nmの励起による発光も測定した。 GFVen148は単量体のVenus148azFに比べて30倍以上の発光強度を示し、517 nmで発光のピークを示した（図7c、補足図12c）。 GFVen148は、予想されるような古典的なFRETを示すのではなく（上図）、蛍光の出力という点では単一体として機能しているように見える。 このことは、sfGFP148x2 で観察された構造的側面（水のネットワークなど）が役割を果たし、2 つの CRO が 1 つの種として主に機能していることを示唆している可能性がある。 CRO の重要な中性 A 状態の存在は、2 つの単量体ユニットが完全に同期していないことを示唆し ている。 しかし、これはGFVen148で見られるような新しいスペクトル特性の生成において、二量体化が持つ明確な影響を否定するものではない。 赤、金、緑、黒の破線はそれぞれGFVen148、Venus148azF、sfGFP148SCO、モノマー添加スペクトル。 b 0.5 μM GFVen148（赤）、Venus148azF（金）の505 nm励起時の発光強度。 c GFVen148 (赤) および Venus148azF (金) の 400 nm 発光時の規格化発光 d GFP148x2 構造に基づく GFP と Venus CRO の空間配置 e GFVen204 の吸光スペクトル。 赤、金、緑、黒の破線はそれぞれ GFVen204, Venus204azF, sfGFP204SCO およびモノマー添加スペクトル。 f GFVen204 （青）と Venus204azF （金）の発光スペクトル。 破線は510 nm、点線は450 nmの励起を表す。 g sfGFP204x2 structure (PDB 5ni3)

sfGFPと同様に、Q204の代わりにazFを組み込んでもVenusのスペクトル特性にはほとんど影響がなかった（補足表3）。 204 SPAACを介した共有結合（GFVen204を作る）により、二量体を生成することに成功した（補足図11）。 GFVen204 は、両方のモノマーのスペクトルの特徴を併せ持ち、490 nm と 514 nm の両方に λMax を持つ種を生成した（比率は 1:1.2）(Fig. 7e, f and Supplementary Table 3)。 Venus204 も 490 nm で吸収するが、514 nm との比率は 1:2.7 である。 二量体を形成すると、個々の単量体よりもモル吸光度が再び増加した。特にεは、sfGFPではほとんど寄与しない金星に関連したλmax (514 nm)に対して〜26000 M-1 cm-1 (〜27%)ほど増加した。 モノマー間の情報伝達を調べるために、4つの波長で励起したときの蛍光発光をモニターした。 400 nm (sfGFP only); 450 nm (sfGFP, minor Venus); 490 nm (sfGFP λmax, Venus shoulder); 510 (Venus, minor sfGFP)である。 すべての励起波長において、唯一の明確な発光ピークは528nmであり（図7b）、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）による通信を示すVenusに対応するものであった。 sfGFP204SCOに対応する発光ピーク（～510 nm）は、sfGFPに特有の低波長での励起でも観測されなかった。 また、GFVen148に特徴的な中間の発光ピークも観測されず、148ヘテロダイマーの新規な特性が浮き彫りになった。 最も顕著な違いは、400nmの励起で観察され、GFVen204ではVenus204azFと比較して528nmの発光強度が14倍増加した（図7f、挿入図）。 スペクトル分解後に計算した相対的なFRET効率は約90%であった。 このように、2つの機能中心はエネルギー移動（図7g）を通じて、非常に効率的にコミュニケーションをとっている。