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Representative Results

ウイルスの力価を正確に評価するプラークアッセイの能力は、多くの要因に依存している：適切なホスト細胞の選択、細胞およびウイルスの生存のための適切な培地および増殖条件、固定化されたウイルスの増殖、および明確かつ計数可能なプラークの形成に十分な時間を与えるためのウイルス培養時間の正確な判断である。

この研究では、異なるサンプルタイプ間でのオーバーレイ選択、培養期間、プラーク形態の違いを示すために、3つの代表的なファミリーからウイルスが選択されました。 Venezuelan Equine Encephalitis (VEEV) が (+)ssRNA ウイルス モデルとして選択され、ウマ科およびヒトに重大な病気を引き起こす可能性があり、トガウイルス科を代表するウイルスです。 インフルエンザB型台湾株は、主にヒトに感染するセグメント化（-）ssRNAウイルスで、Orthomyxoviridae科を代表するウイルスである。 ブニヤウイルス科の代表として、主に節足動物、反芻動物、ヒトに感染する（-）ssRNA節足動物生まれウイルスであるリフトバレー熱ウイルス（RVFV）が選ばれた。

RVFVについては（図1）、CMC、アガロース、またはアビセルのオーバーレイを用いた12ウェルプレートフォーマットで、感染後72時間（hpi）並行してインキュベートしたRVFVの組み換え弱毒MP12株の原液から力価を測定した。 CMCとアガロースオーバーレイを用いたプラークでは、円形の境界がはっきりした、小さく明確なプラークが観察された。 液体オーバーレイを用いたプラークは、アガロースプラークやCMCプラークに比べ、やや多く、大きく、境界がはっきりしないプラークであった。 パネルBでウイルス力価を比較したところ、すべてのオーバーレイが同等であった。

MP12のオーバーレイ間の視覚的比較を明確にするため、また再現性を判断するためにより多くのサンプルサイズを得るために、6ウェルプレートも3連で試した(図2)。 6ウェルプレートでは、CMCオーバーレイはアガロースや液体オーバーレイよりも小さいプラークを示したが、その大きさは同等であった。 RVFVとは対照的に，VEEVの力価およびプラーク形態は，異なるオーバーレイ間で顕著に異なっていた（図3A）． CMCオーバーレイで形成されたプラークは，12ウェルプレートを使用した場合，プラークサイズと感度を犠牲にして，明瞭で明確な形態を示した（パネルB）． CMCとは対照的に、アガロースおよび液体オーバーレイを使用すると、プラークが著しく大きくなり、ウイルス抑制効果が低く、VEEV複製に対する感度が高くなることが示された。 アガロースと液体オーバーレイはCMCよりも大きなプラークを形成したが、プラークは境界がはっきりせず、12ウェルフォーマットで数えるのが困難であった。 プラークを6ウェルプレートで試行したところ（図4）、より大きな6ウェルフォーマットは、12ウェルフォーマットでは区別が困難であったあからさまに大きなプラークの問題を否定し、アガロースおよび液体オーバーレイは、プラークの定義と感度の点でCMCオーバーレイよりも優れていた（図4D）＜4132＞ ＜835＞RVFVやVEEVに比べて、プレーク化の際にインフルエンザは、外部のタンパク質分解の要求など、いくつかの独特の課題をもたらす。 インフルエンザウイルスのオーバーレイの選択に対する感度は、過去にもよく報告されており、アガロースの銘柄の違いと同じくらい小さな変更で、大きな変化が見られた9。 アガロースオーバーレイの使用は、最良のプラークを提供し（パネルC）、より暗い背景染色をもたらし（単層の生存率の増加によるものと思われる）、液体オーバーレイの使用（パネルB）と直接比較して、より明確でシャープなプラークを示した

アガロースやCMCなどの固体および半固体オーバーレイに対する液体ポリマーの明確な利点は、除去と適用の容易さにある。 半固体オーバーレイは加熱が必要であり、固化すると取り扱いや除去の際に問題となることがある。 これらの利点を生かし、RVFVにアビセルをハイスループットで利用する実用性を判断するために、96ウェルプレートフォーマットでオーバーレイ濃度を変えて試用した（図6）。 RVFV MP-12については、アビセルの最終濃度が0.6%と1.2%の両方で、4倍希釈を行った。 オーバーレイの塗布と除去は簡単で、複製間や濃度間の明らかな差は見られず、高い再現性が示された。

図1:12ウェルプレートを用いたRVFVプラークオーバーレイの比較。 Verosを12ウェルプレートに2.5 x 105細胞でプレーティングし、同じ連続希釈したMP12の出発試料を使用して200μlで感染させた。 感染後、0.3%アガロース、0.6%アビセル、1%CMC（最終濃度）を1.5mlオーバーレイし、パネルAで示したようにオーバーレイを直接比較するために、プラークをカウントしてパネルBでタイトルを付けた。 Verosを6ウェルプレートに5 x 105細胞でプレーティングし、同じ連続希釈したMP12の出発試料を用いて400μlで感染させた。 パネルA、B、Cで示したように、オーバーレイを直接比較するために、0.3%アガロース、0.6%アビセル、または1%CMCの3mlオーバーレイを適用した。 Verosを12ウェルプレートに2.5 x 105細胞でプレーティングし、VEEV TC-83ワクチン株の同じ連続希釈出発サンプルを用いて200 µlで感染させた。 感染後、0.3%アガロース、0.6%アビセル、または1%CMCの1.5mlオーバーレイを適用し、パネルAで示したようにオーバーレイを直接比較することができた。 Verosを6ウェルプレートに5 x 105細胞でプレーティングし、VEEV TC-83の同じ連続希釈した出発試料を用いて400μlで感染させた。 感染後、パネルA、B、Cで示したオーバーレイを直接比較するために、0.3%アガロース、0.6%アビセル、または1%CMCの3mlオーバーレイを塗布した。 MDCK細胞を6ウェルプレートに5×105細胞でプレーティングし、同じ連続希釈した出発サンプルのインフルエンザB台湾を使用して400μlの接種物を感染させた。 FBSは、ウイルス融合に必要な特定のプロテアーゼを阻害することにより、インフルエンザの伝播を阻害する可能性があるため、増殖培地やオーバーレイには牛胎児血清（FBS）を使用しなかった。 TPCK-トリプシンは、宿主細胞とのウイルスの融合と侵入を促進するために、適用前にすべてのオーバーレイに添加された。 感染後、パネルA、B、Cで示したようにオーバーレイを直接比較するために、0.3%アガロース、0.6%アビセル、1%CMCの3mlオーバーレイを塗布した。 CMCプラークについては平均をとったが、プラークの境界が拡散し、サイズが非常に小さいため、確実にカウントすることは困難であることがわかった。 1ウェルあたり3 x 104細胞でプレーティングしたベロスの96ウェルプレートに、同じ連続希釈した出発サンプルのRVFV MP12を用いて50μlの接種物を1時間、4重反復で感染させた。 パネルAおよびBでは、ハイスループットな方法で液体オーバーレイを利用することの実現可能性と再現性を判断するため、0.6および1.2%の終濃度を持つアビセルを試用した。

テーブル1:Plaque Assayの接種条件と細胞タイプ

表2:プラークおよびウイルス／細胞増殖メディウム

オーバーレイ溶液は無菌状態が維持されれば製造時に期限はないです。

表3：オーバーレイストック

Table 4: プレートフォーマット