一般的なブロッティングの手順は、ホモジナイズした組織サンプルまたは細胞からトータルRNAを抽出するところから始まります。 その後、オリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィーを用いて、ポリ（A）テールを持つRNAのみを単離することにより、真核生物のmRNAを単離することができます。 RNAサンプルはその後、ゲル電気泳動によって分離される。 ゲルは壊れやすく、プローブはマトリックスに入り込めないため、サイズごとに分離されたRNAサンプルは、キャピラリーまたは真空ブロッティングシステムによりナイロン膜に移される。
電気泳動ゲルからブロッティング膜にRNAを転写するキャピラリーブロッティングシステムのセットアップ
マイナス電荷の核酸はナイロン膜に高い親和性を持っているのでノーザンブロッティングに使用するには、プラス電荷を持つナイロン膜は最も効果的である。 ブロッティングに使用する転写バッファーは、プローブとRNAの相互作用のアニーリング温度を下げるため、通常ホルムアミドを含み、RNAの分解を引き起こす可能性のある高温を必要としない。 RNAはメンブレンに転写された後、紫外線や熱によってメンブレンに共有結合して固定化される。 プローブが標識された後、メンブレン上のRNAにハイブリダイズする。 ハイブリダイゼーションの効率や特異性に影響を与える実験条件としては、イオン強度、粘度、二重鎖の長さ、ミスマッチの塩基対、塩基組成などが挙げられる。 プローブが特異的に結合したことを確認し、バックグラウンドシグナルの発生を防ぐために、メンブレンを洗浄する。 ハイブリッドシグナルはX線フィルムで検出され、デンシトメトリーで定量することができる。 ノーザンブロットの比較対照として、マイクロアレイやRT-PCRで決定した後、目的の遺伝子産物を表示しないサンプルを使用することができる。
GelsEdit
RNA をホルムアルデヒドアガロースゲル上で実行すると28S（上のバンド）と18S（下のバンド）リボソームサブユニットを強調表示する。
RNAサンプルは、二次構造を制限するために、RNAの変性剤としてホルムアルデヒドを含むアガロースゲルで分離することが最も一般的です。 ゲルはエチジウムブロマイド（EtBr）で染色し、紫外線で観察して、ブロッティング前にRNAの質と量を観察することができます。 尿素を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動もRNA分離に使用できるが、断片化したRNAやマイクロRNAに最もよく使用される。 電気泳動ゲル上でサンプルと一緒にRNAラダーを走らせ、得られたフラグメントのサイズを観察することが多いが、トータルRNAサンプルでは、リボソームサブユニットがサイズマーカーとして機能することがある。 大リボソームサブユニットは28S（約5kb）、小リボソームサブユニットは18S（約2kb）なので、ゲル上に2つの顕著なバンドが現れ、大きい方は小さい方の約2倍の強度となる。
ProbesEdit
ノーザンブロッティング用のプローブは、目的のRNAの全部または一部と相補的な配列を持つ核酸で構成されており、DNA、RNA、または目的配列と最低25個の相補塩基を持つオリゴヌクレオチドが使用されます。 試験管内で転写されたRNAプローブ（リボプローブ）は、より厳格な洗浄工程に耐えることができ、バックグラウンドノイズをある程度防ぐことができる。 一般的にcDNAは、ノーザンブロットのプローブとして機能するように、目的のRNA配列の標識プライマーを用いて作成される。 プローブは放射性同位元素（32P）で標識するか、アルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）が化学発光基質を分解し、検出可能な発光を生成する化学発光で標識しなければならない。 化学発光標識には、プローブが酵素に結合している場合と、プローブがリガンド（ビオチンなど）で標識されており、リガンド（アビジンやストレプトアビジンなど）が酵素（HRPなど）に結合している場合の2通りがある。 X線フィルムは放射性シグナルと化学発光シグナルの両方を検出することができるが、多くの研究者は化学発光シグナルを好む。 同じ膜を5回までプローブしても、標的RNAはほとんど失われない
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