薬品および試薬
GTは台湾台中のマーケットから購入した． IS（純度97％）はAlfa Aesar社（Lancaster, UK）から入手した。 6，7-ジメトキシクマリン（6，7-DMC、純度98％）は、Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, U.S.A.)から入手した。 EC（純度90％）、ECG（純度98％）、EGCG（純度95％）、ギ酸、プロベネシド、リン酸（氷河、85％）およびメチルパラベンは、Sigma Chemical Co.から購入した。 (St. Louis, MO, U.S.A.)から購入した。 EGC（純度92.7％）は、ChromaDex, Inc.から入手した。 (Irvine, CA, U.S.A.)から入手した．また，酢酸エチルはLCグレードでECHO Chemical Co. (Miaoli Hsien, Taiwan)から入手した。 アセトニトリルはLC/MSグレードであり、Millinckrodt Baker, Inc.から購入した。 (Phillipsburg, NJ, U.S.A.）から購入した。 ウシ胎児血清はBiological Industries Inc.から入手した。 (Kibbutz, Beit Haemek, Israel)から入手した。 ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン、ダルベッコ変法イーグル培地、トリプシン/EDTA、ハンクのバランス塩溶液および4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸はInvitrogen（カリフォルニア州カールズバッド、USA）より入手した。 ダルベッコ変法イーグル培地F12は、Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.)から入手した。 6-カルボキシフルオレセインは、AAT Bioquest Inc.から購入した。 (Sunnyvale, CA, U.S.A.) から購入し、5-カルボキシフルオレセインは Acros Organics (Geel, Belgium) から入手した。 また、Milli-Q plus water (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) をすべての調製に用いた。
Preparation and characterization of GT infusion
輸液は2または4 gのGTを50 mLの熱脱イオン水（98-100℃）で30分浸漬して製造した。 この輸液を熱いうちにガーゼでろ過して、それぞれ40および80 mg/mLの濃度にし、これを新たに胃内投与でラットに投与した。
GT輸液の特性評価のため、0.2 μm RC15フィルター（Sartorious、Goettingen Germany）で濾過後、濾液100 μLにメタノール900 μLを混合して、沈殿を遠心分離で除去した。 適切に希釈した輸液（50μL）を内部標準として6,7-DMC溶液（メタノール中2.0μg/mL）50μLと合わせ、5μLをLC-MS/MS分析に付した。 HPLCシステムにはAccela 1250ポンプとオートサンプラー（Thermo Fisher Scientific Inc.米国）を用いた。 カラムはPhenomenex® C18 analytical column (150 mm × 1.0 mm, 5 μm) とプレフィルターを使用し，クロマトグラフィ分離を行った。 移動相は0.01%ギ酸含有アセトニトリル（A）と0.01%ギ酸含有水（B）からなり、以下のようにグラジエントでプログラムされた。 A/B: 2/98（0-2分）、15/85（4分）、40/60（6分）、90/10（8-10分）、2/98（12分）。 流速は0.2 mL/minであった。 カラム流出液はQuantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.) を用いてH-ESI (heated-electrospray ionization) -II probeにより検出した。 シースガスには35任意単位で窒素を、補助ガスには10任意単位で窒素を使用した。 衝突エネルギーは-19/18 V，スプレー電圧は-3000/3000 V，キャピラリー温度は350 ℃，気化器温度は350 ℃，チューブレンズオフセットは-80/88 Vとし，選択反応モニタリング分析（SRM）には以下の質量遷移を用いた。 EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) and 6,7-DMC (207/151). ESI-MSスペクトルは、EC、EGC、ECG、EGCGについては負イオンモードで、6,7-DMCについては正イオンモードで記録した。
動物
雄のスプラーグ・ドーリーラット（270-360 g）を国立実験動物センター（台湾、台北）から購入して、12時間明暗サイクルの調整環境内で飼養した。 餌と水は実験の12時間前まで自由に摂取させた。 ラットは2つのグループに分けられた。 最初の実験は、CRFラットのISおよびPCSの血清レベルに対するGTの効果を決定するために28匹のラットを使用した；2番目の実験は、CRFラットの腎機能に対するGTの効果を評価するために14匹のラットを使用した。 すべての動物実験は、中国動物科学学会（中華民国、台湾）発行の「実験動物の世話と使用のためのガイドブック（2002）」の勧告に厳密に準拠して実施された。 実験プロトコルは、2014年8月1日に、中華医科大学（台湾）のInsititutional Animal Care and Use Committeeにより審査・承認された（許可番号：103-126-N）
CRFモデルの構築およびGT注入の投与
CRFは、先行研究に従ってアデニン経口投与により誘導したが、若干変更した19、23、35、36． すなわち、0.5％メチルセルロース400に懸濁したアデニン（15 mg/mL）を28匹のラットに1日2回、実験期間中7回連続（15 mg/ラット）で胃から経口投与した。 4日目にISの血清中濃度を測定した。 血清IS濃度の有意な上昇により腎機能が減弱したことを確認した後、CRFラットをIS濃度が同程度の3群（各群8～10匹）に分けた。 第1群には400 mg/5 mL/kgのGT点滴を1日2回、7回連続投与し、第2群には200 mg/5 mL/kgのGTを1日2回、7回連続投与し、第3群にはコントロールとして水5 mL/kgを並行して投与した。 8日目、ラットは一晩絶食後9時にGTの7回目を投与し、投与後0、15、30、60、120、180および360分に血液サンプルを採取した。 採血予定時刻、アデニンとGTの投与予定時刻をFig.3にまとめた。 各採血時刻に、イソフルラン麻酔下で0.5 mLの血液を採取した。 血液サンプルをマイクロチューブに採取し、10,000 gで15分間遠心分離して血清を得、分析前に-20 ℃で保存した。
血清中のISおよびPCS濃度の測定
血清中のISおよびPCS濃度の測定は、血清検体50μLに内部標準としてそれぞれ10μg/mLの6，7-DMCまたは100μg/mLのメチルパラベンを含むメタノール200μLでボルテックスした後遠心分離して沈殿物を除き、20μLアリコートをHPLC分析の対象とした。
キャリブレーターは、50μLの血清にISとPCSをそれぞれ0.4〜25.0μg/mL (1.8-117.3μM) と0.3〜20.0μg/mL (1.7-106.3 μM)の濃度でスパイクしたものを用意し、遠心分離して沈殿を除去した後、20μLの分注をHPLC分析に供しました。 後の手順は、前述の血清試料に準じた。 検量線は、ピーク面積比（ISまたはPCSと内部標準の比）を既知濃度のISおよびPCSに対してそれぞれ線形回帰することにより作成しました
HPLC装置は、ポンプ（LC-10AT、島津、京都、日本）、蛍光検出器（RF-20A、島津、京都、日本）および自動注入器（SIL-10AF、島津、京都、日本）により構成されています。 Apollo C18 (5 μm, 4.6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) カラムにガードカラム (4.6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Japan)を装着した。 移動相はアセトニトリル (A)-0.1% リン酸 (B) からなり、以下のようにグラジエントでプログラムした。 A/B: ISは15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) and 15/85 (24-35 min), PCSは16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) and 16/84 (24-36 min)のグラジエントプログラムで行った。 検出器の設定は、ISがEx 280 nm/Em 375 nm、PCSがEx 214 nm/Em 306 nmである。
Effect of GT on Cr and BUN in CRF rats
別の実験では、上記と同じ動物プロトコルを採用し、アデニン投与前（Day 0）、GT投与前（Day 4）、GT7回目投与後（Day 8）のCrとBUNの濃度を測定した。 4日目のCr及びBUNの著しい上昇により腎機能の減弱を確認した後、CRFラットをCr濃度が同程度の2群（1群7匹）に分けた。 第1群にはGT 400 mg/5 mL/kgを1日2回、7回連続投与し、第2群にはコントロールとして水5 mL/kgを並行して投与した。 8日目、ラットは一晩絶食後、GTおよび水の7回目を投与され、30分後に血液サンプルが採取された。 CrはADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.) のkinetic alkaline picrate methodで測定した。 BUNは、同じ分析装置を用いて、ウレアーゼ/グルタミン酸デヒドロゲナーゼ結合酵素反応によって測定された。
細胞株及び培養条件
輸送研究に使用した安定的にトランスフェクトした細胞株、hOAT1を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（CHO-hOAT1）、hOAT3を発現するヒト胚腎293（HEK）細胞（HEK-hOAT3）及びそれに対応する空のベクターをトランスフェクトした対照細胞株の構築は、以前に記載したとおり40，41である。 CHO細胞は、10%血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1 mg/mL G418を含むDMEM F-12培地(Thermo Fisher Scientific Inc., USA)において、37℃、5%二酸化炭素で維持した。 HEK細胞は、DMEM高グルコース培地（Thermo Fisher Scientific Inc.）中、37℃、5％CO2で維持した。 細胞はPoly-D-Lysineでコートしたディッシュで培養した。
GTの血清代謝物（GTM）の調製と特性評価
生体内でOATと相互作用する分子を模倣するために、GTMをラットで調製して特性評価を行った。 簡単に説明すると、一晩絶食させたラットにGT注入液（800 mg/10 mL/kg）を経口投与した。 投与後15分に採血した。 凝固後、血清を採取し、3倍量のメタノールでボルテックスした。 10,000 gで15分間遠心分離した後、上清を回転式エバポレーターで真空下、乾燥するまで濃縮した。 残渣に適当量の水を加え、血清濃度の10倍の溶液を得、これをアリコートに分けて-80℃で保存し、後で使用した。 簡単に説明すると、血清サンプル100μLをサルファターゼ50μL（サルファターゼ1000単位/mLとβ-グルクロニダーゼ39,861単位/mlを含む）、アスコルビン酸50μL（200mg/mL）と混合し、37℃で45分間嫌気的条件下でインキュベーションさせた。 加水分解後、血清を50 μL 0.1 N HClに加え、250 μLの酢酸エチル（内部標準として100 ng/mL の6,7-DMCを含む）で分配した。 酢酸エチル層はN2下で蒸発乾固し、LC-MS/MS分析前に適量の移動相で再沈殿させた。 移動相は、アセトニトリル（A）-0.1%ギ酸含有水（B）からなり、以下のようにグラジエントでプログラムされた。 A/B: 2/98（0-2分）、15/85（4分）、40/60（6分）、90/10（8-10分）、2/98（12分）。 流速は0.2 mL/min。
hOAT1およびhOAT3を介した取り込み輸送に対するGTMの影響
CHO-hOAT1およびHEK-hOAT3細胞（1×105個/ウェル）を、96ウェルプレートで培養した。 hOAT1およびhOAT3の活性に対するGTMの効果を評価するためのプローブとして、6-Carboxyfluorescein（6-CF）および5-Carboxyfluorescein（5-CF）をそれぞれ使用した47,48。 さらに、hOAT1 と hOAT349 の阻害のためのポジティブコントロールとしてプロベネシド (80 μM) を使用した。 CHO-hOAT1またはHEK-hOAT3の24時間または48時間のインキュベーション後、培地を除去し、PBSバッファーで3回洗浄した。 輸送実験の前に、CHO-hOAT1およびHEK-hOAT3細胞を試験剤（GTMおよびprobenecid）と共に37℃でプレインキュベーションした。 30分インキュベーション後、6-CFまたは5-CFを加え、それぞれさらに5分および10分インキュベートした。 プレートを直ちに氷浴上に置き、上清を除去し、氷冷したPBSで細胞を3回洗浄した。 その後、100 μL の 0.1% Triton X-100 を加えて細胞を溶解し、蛍光を 485 nm の励起光と 528 nm の発光光で測定した。 各ウェルのタンパク質含有量を定量するために、10μLの細胞溶解液を200μLの希釈タンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）に加え、570nmの光学密度を測定した。 57＞＜340＞データ解析＜7374＞＜9825＞実験観察から血清中ピーク濃度（Cmax）を求めたところ、6-CFまたは5-CFの細胞内相対蓄積量は、タンパク質補正後のコントロールのそれとの比較で算出された。 血清濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）は、台形法則を用いて最終点まで算出した。 3群間のISとPCSの差は一元配置分散分析で，2群間のCrとBUNの差はp＜1081＞0.05を有意水準として，unpaired Studentのt-testで分析した． また，in vitroの解析には，unpaired Student’s t-testを使用した
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