初期の問題点編集
Thermolability編集
FLP-FRT組み換え酵素の初期適用が哺乳類でうまくいかなかった。 FLPタンパク質は熱に弱い (高温で変性する) ため、これらのモデル系の体温が上昇しているため、哺乳類モデルでは役に立たなかったのです。 しかし、Cre-Lox組換えの特許や使用制限のため、より耐熱性の高いFLP-FRTカセットの作製に大きな関心が寄せられました。 最初の成果のいくつかは、Buchholzら(1997)によって、大腸菌でのサイクリング変異誘発を利用して生み出された。 一つはアラビノースプロモーターの下流でランダムに変異させたFLPタンパク質をコードするプラスミド、もう一つはFRTカセット内にlacZ遺伝子プロモーターを含むプラスミドである。 大腸菌はアラビノースプレート上で37℃と40℃で培養され、組換えが起こるとlacZの発現が減衰し、コロニーが白く見えるようになる。 各世代から白いコロニーを選び、新しいアラビノースプレート上で前と同じ温度で8世代にわたって培養した。 ウェスタンブロッティングにより組換えを確認し、変異したFLP遺伝子の配列を決定した後、この第8世代のFLPタンパク質（FLPe）を哺乳類細胞培養にトランスフェクトし、哺乳類細胞における組換えを確認した。 このFLPの変異体は4つのアミノ酸の置換のみである。 6604>
Generation of genetic mosaicsEdit
Genetic mosaicism occurs within an organism when similar cell types express different phenotypes due to dissimilar genotypes at specific loci. 簡単に言えば、1つの生物に異なる遺伝子型が含まれる場合に発生するもので、通常、自然界では稀な現象です。 しかし、FLP-FRT組換えを用いると容易に（かつ問題なく）発生させることができる。 もし2つの異なるFRT部位が細胞内に存在し、FLPが適切な濃度で存在すれば、FRTカセットは2つのFRT部位の間で切り取られ挿入され続けるだろう。 このプロセスは、FLPタンパク質が必要な濃度を下回るまで続き、その結果、生物内の細胞は異なる遺伝子型を持つことになる。 これはミバエからマウスまで見られ、特定の染色体（体細胞および性細胞）または細胞タイプ（体細胞および生殖細胞）に対して無差別である＜6604＞＜6435＞細胞系列の決定編集＜2880＞＜6708＞Dymeckiら（1998）の出版以前は、Creリコンビナーゼが、En2プロモータを用いてマウスにおける神経前駆細胞の細胞運命マッピングに使用されていた。 そこで、Dymeckiら（1998）の著者らは、FLPリコンビナーゼがマウスにおいてCreリコンビナーゼと同様の方法で、同様の効果を持つように利用できるのではないかと考えた。 すなわち、神経細胞Wnt1::Flp融合株と、tm1Cwrの18番目のエキソンに隣接するFRTカセットを持つ株である。 このエキソンを切除するとヌル表現型になることから、このエキソンを切除することにした。 著者らは2つの系統を交配し、子孫を成体に到達させた後、子孫を犠牲にした。 神経系、筋肉系、腸管系、尾部の組織からRNA抽出が行われた。 逆転写PCRとノーザンブロッティングにより、tm1Cwrの18番目のエキソンの切除が脳組織で多く、筋肉組織で中程度（筋肉内のScwhann細胞による）確認された。 予想通り、他の組織では切除は見られなかった。 筆者らはFLPリコンビナーゼの細胞運命決定における効率はCreリコンビナーゼと同等かそれ以上と見ている。
In Drosophila melanogaster (Fruit Fly) Edit
これまで、FLPリコンビナーゼはD. melanogasterで何度も利用されている。 D. melanogasterにおけるFlpリコンビナーゼとCreリコンビナーゼの比較は、Frickenhausら（2015）により発表された。 Frickenhausら（2015）の著者らは、Flpリコンビナーゼ「ノックアウト」とCreリコンビナーゼ「ノックアウト」およびRNAiノックダウンとの効果の特徴づけと比較、およびハエのFUSに対するオルソログであるcabeza（caz）のD. melanogasterのニューロンおよび筋肉組織における機能を明らかにすることという二つの目的をもっていた。 FUSは、ヒトの筋萎縮性側索硬化症（ALS）や前頭側頭型認知症に強く関与しているとされている。 著者らは、elav-Gal4/UAS-FlpまたはCreシステムを用いてリコンビナーゼを神経細胞に特異的に発現させ、Mef2-Gal4/UAS-FlpまたはCreシステムを用いてそれを筋肉に特異的に発現させた。 著者らは、Flpリコンビナーゼ「ノックアウト」ツールは、Creタンパク質とRNAi転写物の両方に見られる漏出発現がないため、特定の組織や細胞株において特定の遺伝子をノックアウトする目的で、RNAiやCreリコンビナーゼよりも有効であると結論づけている。 また、Flpタンパク質では見られないCreタンパク質の毒性も見られた。
In Danio rerio (Zebrafish)Edit
FLPe recombinase systemの有効性はWongら（2009）によりゼブラフィッシュで評価された。 筋肉特異的プロモーターの下流にFRT-flanked enhanced green fluorescent protein（EGFP）を持つヘミ接合体である胚に、FLPeタンパク質を注射した。 FLPeがない場合、これらの胚はすべての筋肉組織でEGFPを発現するはずであり、野生型と交配した場合、得られる子孫の50%も筋肉組織でEGFPを発現するはずである。 FLPeを注入した胚は筋肉組織におけるEGFPの発現が著しく低下し、モザイク化も見られた。 これらの胚が成体に達したとき、野生型株と交配し、得られたクラッチでは、筋肉組織でEGFPを発現する子孫が著しく減少した（0-4％）。 これらの結果は、FLPeが体細胞で非常に有効であるだけでなく、ゼブラフィッシュの生殖細胞でも非常に有効であることを示している。
In plantsEdit
Creation of “phytosensors” or “sentinels” in Arabidopsis thaliana and TobaccoEdit
Phytosensors are genetically modified plants that can report the presence of biotic or abiotic contaminants.これは、植物が生物学的汚染物質の存在を知らせることができる、遺伝子組み換え植物である。 明らかに、これらの工学的植物の生産は、農業や研究室で大きな期待を集めている。 しかし、適切なレポーターベクターを作成することは問題であることが示されている。植物の遺伝子の転写活性化にはcis-regulatory要素が大きな役割を果たすが、その多くはよく理解されていない。 多くの植物センサーは、合成プロモーターのために、レポーター遺伝子の発現が不十分であったり、偽陽性を示したりする。 Raoら（2010）の著者らは、FLPリコンビナーゼツールを利用して、高効率なファイトセンサーの作製に成功した。 著者らは熱ショックプロモーターを用いてFLPの生産を誘導し、FRT-flankedベクターでCaMV 35Sプロモーターとβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）を分離させた。 熱ショックに曝すと、FLP誘導によりFRT-flanked vectorが切除され、GUS遺伝子はCaMV 35Sプロモーターの直下に移動した。 GUSの活性化により、植物の葉は緑から青に変化した。このように、ファイトセンサーはモデル系にストレスを効果的に伝えた！
Cre-recombinaseで編集
Gate-way-ready inducible MiRNA (GRIM) expression systemの製作編集
RNAiは真核生物の遺伝子発現と遺伝子ノックアウト可能性におけるパラダイムシフトを引き起こした。 GRIM発現システムの製造以前は、RNAiベクターの作成は高価で時間がかかるものでした。 ベクターは、従来のコピーアンドペーストの分子クローニング法で作製されていた。 Garwick-Coppensら（2011）は、RNAiの発現をCre-recombinaseでノックイン、Flp-recombinaseでノックアウトできる、より効率的なRNAiベクターの作製方法を開発した。 この新しいGRIM Expression Systemにより、人工RNAiコンストラクトを含む発現ベクターをより迅速に作製することが可能になりました。 さらに著者らは、この発現システムが、分子生物学研究において一般的なヒト不死化細胞株であるヒト胚性腎臓（HEK）細胞で非常に効果的に機能することを示しました
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