目次
はじめに｜組織採取｜FFPE組織処理｜切断｜参考文献
研究用にFFPEサンプルやその他のヒト生物試料が必要でしたら、弊社までお問い合わせください。
はじめに
記録されるFFPE組織標本ブロック
今日の研究者の多くは、IHC、組織学、in situゲノム解析にFFPEサンプルの組織を好んで使用します。 FFPEは「Formalin-Fixed Paraffin-Embedded」の略で、この組織保存法の2つの主要な特徴を示しています。 ホルマリンはホルムアルデヒド溶液で、1800年代後半にドイツの医師Ferdinand Blumがホルムアルデヒドの防腐効果を発見して以来、使用されている（Fox, et al.） ホルムアルデヒドで固定した後にパラフィンを注入し、さらにパラフィンのケーシングで組織を囲み、組織を支え、酸化から保護します。 専門家が固定・埋込んだFFPEサンプルとそこに含まれる生体分子は、常温でそれなりに安定しています。 構造的には、固定・包埋された組織は弾力性があり、ほぼ無期限に顕微鏡解剖学的研究に使用できますが、時間の経過とともに一部のタンパク質の抗原性が低下するため、IHC研究は数十年前のサンプルに限定されます。 FFPEブロックでは二本鎖DNAは驚くほど安定しているが、RNAなど他の安定性の低い生体分子は、特に切片が切り取られると10年以内に分解される可能性がある
特定の適応症の特性について統計的に確かな結論を導き出すために多くのケース（つまり複数のドナーからのFFPEサンプル）を比較したい場合、大量のFFPEサンプルを蓄積したアーカイブは特に豊富なデータソースとなる。 FFPE標本が「重要な」生物医学的研究に使用される場合、調製プロセスの各段階が、十分に訓練され認定された専門家によって、できればCLIA認定（すなわち政府の検査）またはCAP認定（米国病理学会）の研究室で実施されることが重要である。
FFPEサンプルの連続したセクションのリボン（顕微鏡スライド用）
FFPEプロセスは普遍的に標準化されていないため、世界中の機関が異なるホルマリン溶液でわずかに異なるプロトコルを使用するか、あるいは好みや要件に応じてプロセスを調整することができることに注意すべきです。 以下は、プロセスの概要と各ステップの内容、および一般的なバリエーションについての説明です。
Tissue Acquisition
組織処理の前に、組織の取得という必要なステップがあります。 これは、患者ケア、41 CFR46の遵守、そして米国では内部審査委員会（IRB）の監督と絡み合っているため、実は最もコントロールが難しい要素なのです。 麻酔の投与と血管の結紮の時間間隔、組織の取り出し、固定までの経過時間などの変数に影響を与え、そのいずれもが試料の品質に影響を与える可能性があるため、医療処置の詳細と標準治療の慣習が重要である。 例えば、RNAやタンパク質の変化は、血液供給の結紮から組織除去までの、温熱虚血時間として知られる時間間隔に生じやすい（Dash, et al.、2002）。 この虚血時間は、臓器、施設の標準作業手順、関与する外科医および他の医療従事者、および外科的アプローチによって、数分から数時間の範囲に及ぶことがある。 そのため、この時間は各標本について記録し、最小限に抑えることが推奨されている（Hewitt, et al., 2008）。
FFPE Tissue Processing
組織サンプルが取得されると、残りの処理工程を通過する組織の特定の部分を分離して準備するために、追加のトリアージ、解剖またはマイクロダイセクション（総称してグロースと呼ぶ）が必要になる場合もある。 今日の組織処理は、最終ステップである包埋まで完全に自動化されていることが多いが、これは手動で行われることもある。 多くの組織処理機がありますが、すべて上記の最初の4つのステップの順序に従います。
固定
固定は、FFPE組織処理の最初のステップであり、このステップは、FFPEサンプル間の実験結果のばらつきの原因となる手順のばらつきをなくすのに役立つ。
– Solution
多くの研究室で使用されている固定剤は、中性緩衝液、10％ホルマリンです。 ホルマリンは、水に37～40％のホルムアルデヒドと10％のメタノール（重量比）を溶かした液体で、10％ホルマリン溶液は約3.7～4％のホルムアルデヒドと1％のメタノールを含んでいます（Hewitt, et al.） 実際には、ホルムアルデヒドは、主にホルムアルデヒドと水との可逆反応により生成されるメチレングリコール（メタンジオール、ホルムアルデヒド一水和物）のモノマーまたは小さなポリマーとして溶液中に存在します。 高重量のメチレングリコールポリマーはパラホルムアルデヒドと呼ばれ、溶液から析出しますが、メタノールはこの重合プロセスを遅くするため、ホルマリン溶液に含まれる理由となっています。 水で希釈したホルマリン（10％ホルマリンなど）、特に緩衝液の場合は、ホルムアルデヒド濃度の高い溶液に通常存在するメチレングリコールポリマーを膨大な数の水分子が分解するため、主にモノマーを含むことになる（Kiernan, 2000）。 ホルムアルデヒドは酸化してギ酸になる性質があるため、ホルマリンに含まれる残りの成分である緩衝剤も添加される（Fox, et al.） 組織固定におけるギ酸は、一部の寄生虫が産生する色素に類似したホルマリン色素（酸性ヘマチン）顆粒を沈殿させることがある（Pizzolato, 1976）。 ホルマリンの緩衝化は、このような事態を防ぐために行われる。 一般的な緩衝剤には、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、クエン酸塩、トリス、リン酸塩緩衝剤などがある（Hewitt, et.al.） 市販のホルマリンには、リン酸塩緩衝剤が含まれていることが多い。 「ホルムアルデヒドとメチレングリコールの分子量が低いため、ホルマリン（主に溶液中のメチレングリコール）は比較的早く組織に浸透し、その速度は組織の種類によるが平均1mm/時である（Hewitt, et al.,2008）。 そのため、固定する組織の種類によって、固定のためのプロトコルは異なる。 組織内に入ると、溶液中に存在するホルムアルデヒド分子の割合は、タンパク質と架橋し始めるが、この速度は拡散速度よりもはるかに遅い。 組織との反応によりホルムアルデヒドは溶液から引き出され、ホルムアルデヒドからメチレングリコールへの可逆的反応をホルムアルデヒドの方向に引き戻すので、ホルムアルデヒドが消費されてもさらに生成される（Fox, et al, 1985）。 リジンのアミノ側鎖はホルムアルデヒドと最も反応性が高いが、その他にもアルギニン、アスパラギン、ヒスチジン、グルタミン、セリン、チロシンなどホルムアルデヒドとやや反応性の高いものがある（Howat and Wilson, 2014）。 反応後、得られた複合体に結合したヒドロキシメチル基は、さらに同じタンパク質や他のタンパク質と反応し、安定なメチレンブリッジ（タンパク質-CH2-タンパク質）を形成します（Kiernan, 2000）。 ホルマリン固定された組織が不溶性で硬くなるのは、このためである。 この架橋が組織全体に十分に起こるには約24～48時間必要であるが（Thavarajah, et al., 2012）、それ以上の時間固定すると抽出できる核酸の長さが短くなるなど、FFPEサンプル中の生体分子の質が低下するため、36時間以内に行うことが推奨されている（Hewitt, et al, ホルムアルデヒド（特に中性緩衝10％ホルマリン）を使用する主な利点は、さまざまな組織や成分を保存できることです。 しかし、これには限界があります。 例えば、電子顕微鏡観察には、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒド（C5H8O2）の組み合わせ、またはグルタルアルデヒド単独の溶液が一般的に使用されています（Kiernan, 2000）。 グルタルアルデヒドまたはグルタルアルデヒド-アルデヒド溶液で調製された組織は、FFPEサンプルとはみなされないことに注意する。 ホルマリンは核酸を修飾する傾向があるため（DNAに人工的な変異をもたらすほど）、FFPE組織からDNAおよびRNA分子を回収することも課題です（Srinivasan、Sedmak、およびJewell、2002年）。 しかし、Tangら(2009)のプロトコルにあるように、FFPE組織から分析に適したDNAやRNA断片を抽出することは可能であり、核酸回収の鍵となるのは適切なプロテアーゼ消化である。 FFPEサンプルから核酸を抽出する市販のキットも販売されている。
– Specimen Thickness
ホルマリン固定に関して考慮すべきもう一つの大きなポイントは、組織サンプルの厚さである。 ホルマリンは比較的早く組織に浸透しますが、前述のように組織の厚みは固定されたサンプルの品質に影響します。 厚い組織サンプルの中心部にホルマリンが到達するためには、より多くの時間を必要とします。 ホルマリンが試料の最奥部まで徐々に拡散していく一方で、外側の領域ではすでに固定が始まっているため、完全固定に必要な時間が長くなると生体分子が分解されやすくなります。 また、時間制限（前述の最大36時間など）を設けると、組織サンプルの全体が十分に固定（保存）されない可能性がある。 このため、固定する組織の幅が数ミリから1～2センチ程度と大きい場合は、より薄く剥離した方が最適な固定が可能となる（Hewitt, et al.） 幅の異なる組織サンプルに必要な時間や固定液の量については、施設によって異なるプロトコルがあるかもしれませんが、一般的には固定液の量と組織の量の比率は10：1であるべきです（Klatt、2016）＜8597＞ ＜3340＞脱水＜9103＞ ＜2476＞FFPE標本処理の第2のステップは、脱水です。 パラフィンは水と混和しないため、パラフィンが組織に浸透する前に、ホルマリン溶液の水分をすべて除去する必要があります。 70％アルコールから始まり100％アルコールに至る一連のアルコール（多くはエタノール）溶液を使用して、組織から実質的にすべての水分を除去することができます。 使用するにつれてアルコールは次第に希釈されていくので、最適な脱水を行うためには、新しい溶液を使用するか、使用した溶液を頻繁に交換する必要があります。
クリアリング
パラフィンは実はアルコールにも混和しないので、次のステップはパラフィンと混和する物質でアルコールを除去することです。
パラフィン浸潤
適切な固定、脱水、クリアリングの後、組織は最後にパラフィン浸潤（または含浸）を受けることができます。 この工程も標準化されておらず、世界中の施設がさまざまな組成のパラフィンやワックス混合物を使用している可能性がある。 パラフィンは融点や質感が異なるため、最終的な組織ブロックやその特徴に影響を与える。 米国および西ヨーロッパでは、最良の結果を得るために、通常、低融点（55℃～63℃）の合成パラフィンが使用されています。 ラテックス、ジメチル・スルホキシド、および独自の「可塑剤」は、最終組織サンプルの質感と可塑性を修正するために配合に含まれることがあります (Hewitt, et al., 2008)。
他の地域の国は、可塑性を改善し使用する低質パラフィンの溶融温度を下げるために、配合にミツロウを組み込むことがよくあります。 しかし、蜜蝋は花粉などの汚染物質を含んでおり、最終的なサンプルの品質を低下させます。 融点が高くなると、組織標本の脱パラフィン化が不十分となり、組織から回収できる核酸の量も減少するため、避けるべきである（Hewitt, et al. パラフィンを浸透させた組織標本は、パラフィンの被膜で囲まれます。 ミクロトームでブロックから薄切片をスライスする際の切片面に影響するため、型（「カセット」）内の組織ブロックの向きを正しくするよう注意する必要がある（Klatt, 2016）。 パラフィンケーシングが固化すると、FFPEブロックは保存の準備が整い、何年、何十年にもわたって良好な保存状態を保つことができます（Hewitt, et al. 組織はパラフィンの前面に対して必ずしも完全に平坦ではないため、組織技師は通常、ブロックに「向き合う」必要があります。 組織ブロックはミクロトームのブロックホルダーに入れられ、組織をできるだけ無駄にしないようにブロックホルダーの角度を調整しながら、組織技術者はハンドホイールを回してブロックを鋭利な刃に当てて上下に動かします。 組織の代表的な部分がブロックの最前面にくるまで、ブロックを切断します。 組織が手前に来たら、ブロックを氷の上に置いて冷やすと、薄い切片の切断が容易になります。 ブロックが冷えたら、ブロックホルダーに戻します。 技術者は再びハンドホイールを回しますが、今度はゆっくりとしたペースで回すことで、薄い切片が互いにくっつき、「リボン」のように連続的に形成されます。” リボンを温水浴（パラフィンの融点より少し低い温度に保つ）の上に置き、できたシワをなめらかにする。
組織切片の最も一般的な厚さは、3～5ミクロン（略してミクロン）で、これは細胞1個の厚さに相当します。 3～5ミクロンの切片のスライドは通常、標準的なヘマトキシリン&エオシン（H&E）染色、特殊染色、免疫組織化学（IHC）染色など、染色に使用されます。 研究者は、スライド上の薄い切片の代わりに、しばしば「カール」を要求する。 カールとは、エッペンドルフチューブに入れられた厚い切片（10ミクロン以上）のことで、通常、FFPEサンプルからRNAやDNAを抽出する必要がある場合に使用されます。 厚い切片は、チューブの代わりにスライドに入れることもできます。これは、組織の一部だけを抽出に使用する場合に最適です。 この場合、組織はスライドから削り取られてチューブに入れられる。 切片化されたFFPEサンプルは構造的に安定しており、適切に処理・保管すれば切片化後しばらくは顕微鏡分析に使用できますが、化学的抽出を行う場合は、露出した標的分子の酸化的・生物学的劣化を防ぐため、一般に切片は切断後できるだけ早く使用する必要があります
特定の適応症を表す組織学およびFFPEブロックの調達について情報をお探しですか。 組織学のリソースページをご覧ください。 このような場合、「Lab-Ally」は、45 CFR46および21 CFR11のコンプライアンス、倫理的に調達されたヒト生物資源保管庫、バイオインフォマティクス、科学データ管理などにおいて業界をリードする存在です。 ホルムアルデヒド固定法。 The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
から取得した。