Citrobacter BSI isolates
BSI を引き起こす他のグラム陰性種と比較して，C. freundiiの宿主環境における生理に関する情報は限られている． この欠点を解消する目的で、まずミシガン大学保健システム内のBSI患者からC. freundii complexに属する8株を分離した。 リボソームRNAに基づく系統分類では、Citrobacter属を3つのグループに分けることができ、そのうちグループIには少なくとも8種が含まれ、C. freundiiが含まれる23,24。 しかし、16S rRNAの配列や質量分析に基づく同定アプローチでは、このグループのCitrobacter属の系統解像度は限られている。 そこで、本研究で使用した分離株は、さらに多座配列解析のアプローチを用いて評価した。 収集した8株のうち、6株はC. freundiiの既設株と密接にクラスター形成しており（図1）、タイプ株ATCC 8090との平均塩基同一性は98%であり、これは同種の分離株について一般的に認められている95%のカットオフ値を上回っていた。 残りの2株のうち、UMH17はCitrobacter pasteuriiのタイプ株CIP 55.13と、UMH18はCitrobacter werkmaniiと最も近いクラスターを示した。
本調査で収集した株の系統的分布 最尤樹は連結したfusA, leuS, rpoB, pyrG対立遺伝子の塩基配列から作成した。 タイプ株の情報がある場合はそれを含め、本研究で収集した株（UMH13-19とHM38）は赤文字で示した。 C. koseriiとC. freundii複合体に属する8種との間のノードに手作業で根を張った。 7655>
C. freundii bacteremia
BSIにおけるCitrobacterの適性要件を調べる前に、他の腸管種を用いた以前の研究に基づいて、菌血症のマウスモデルが開発された25。 CitrobacterのBSI分離株のうち、UMH14株とUMH15株が本研究で使用する候補として選択された。 UMH14 株は、尾静脈注射後 24 時間で脾臓および肝臓においてより一貫した用量依存的なコロニー形成を示し（Fig. S1）、さらなる特性評価のために選択された。 また、トランスポゾン変異体の大規模なコレクションを用いて、個々のC. freundii遺伝子のフィットネスへの寄与を評価する前に、コロニー形成のボトルネックの可能性について感染モデルをテストする必要があった。 UMH14の自然発生的なナリジクス酸耐性変異体（UMH14Nal）を単離し、リッチ培地で親株と共培養したところ、in vitroでの適性は同等であると判断した（Fig. S2）。 個々のクローンが確率的に失われることなく、多様な変異体集団が血流中に定着するかどうかを調べるため、UMH14Nal株とUMH14株を異なる比率で混合し、マウスに接種した。 24時間後、1：10,000（UMH14Nal：UMH14）までの比率で、脾臓に存在しない株が自然消滅することなく耐えられ（図S2）、このモデルを用いて、1匹のマウスに、5×107個の菌量で少なくとも1万個の固有のトランスポゾン変異体が収容できることが示された。
菌血症モデルにおけるシトロバクターフィット遺伝子を同定するために、>44000ユニークな挿入部位を表すランダムなトランスポゾン挿入変異体5プールをマウスに注入し、24時間後に脾臓にコロニーを作る細菌を回収した（Fig. S3）。 ハイスループット配列決定によって決定された、接種物および脾臓の出力における個々のトランスポゾン変異体の相対的存在量は、このモデルにおける細菌の生存に寄与する遺伝子を特定するために使用された。 合計177のトランスポゾン破壊遺伝子は、フィットネスの有意な損失を与え、9つの遺伝子は、変異させたときの細菌フィットネスの増加と関連していた（fold-change ≥2.0, Adj. P < 0.05）(Data S1)。 このデータセットを用いた2回目の解析では、入力集団のリード数が、利用可能なTAサイトとライブラリ集団のサイズに基づく予想よりも著しく低い546の染色体エンコード推定必須遺伝子を同定した（logFC <-5.17）（Data S2）。 この日和見感染と全身感染のモデルを用いると、同定された適応因子の大部分は、原型的な病原性因子（例えば、タンパク質毒素や接着剤）ではなく、中核的な生理的プロセスを表すと予想された。 実際、有意な体力低下と関連した177遺伝子をClusters of Orthologous Groups（COG）により分類したところ、C. freundii菌血症時に必要な代謝経路と細胞維持機能が優勢であることがわかった（図2）。 同定されたフィットネス遺伝子の約半数は、エネルギー生産、アミノ酸代謝、DNA複製と修復、翻訳、細胞壁と膜の生合成を網羅する5つのCOGカテゴリーに大別された。
COG分類による C. freundiiフィットネス要因の分布。 有意基準を満たした菌血症fitness factorのアミノ酸配列をCOG分布解析した。 図示しないCOGクラスには、177のfitness factorのうち代表的なタンパク質が含まれていなかった。 7655>
Validation of individual fitness gene mutants
C. freundii fitnessに対する個々の遺伝子産物の寄与は、選択したUMH14遺伝子に構築した独立した欠損-挿入変異で確認した（Table 1）。 ここで報告されたすべての工学的株は、リッチ培地での増殖により決定された総複製欠損を欠いていた（図S4）。 表1に示した各遺伝子について、個々の変異体とUMH14親株を共感染させることにより、適合度を測定した。 最初にテストした7つの変異体のうち5つは、脾臓または肝臓のどちらかで統計的に有意な競合的不利を示し（図3A）、それによってトランスポゾンスクリーンの結果が確認された。 ZnuABC亜鉛輸送システムのマウス感染への寄与を示す他の細菌種からの証拠にもかかわらず、トランスポゾン・スクリーニングの結果がこの遺伝子に関連する適性障害がないことを示したので、ここでは検証のための陰性対照としてznuB突然変異体が選択された26,27,28。 UMH14との競合では、znuB変異体は、予想された結果と一致し、有意な適性欠損を示すことができなかった。 UMH14の隣接するznuA (fold-change = 1.5, Adj. P = 0.527) とznuC (fold-change = 2.0, Adj. P = 0.035) 遺伝子もトランスポゾン挿入によって変異させると、フィットネス欠陥がないか、最小限の欠陥を与えた (Data S1)。
C. freundii選択変異体の競合伝染病菌。 (A) C. freundii UMH14親株と変異体誘導体の混合物（1：1）を尾静脈注射でマウスに共接種した。 24時間後に存在する野生型と変異型の菌数を用いて、脾臓（丸）および肝臓（四角）に生息する菌のCIを算出した。 znuB変異体はフィットネス不良が予想されなかったため、黒丸で区別した。 相対的な適性に変化がないことを示す1.0の仮想的なCIは点線で表されている。 アステリスクは、Wilcoxon符号付き順位検定で決定された仮説値と比較して、適応度の中央値（実線の横線）に有意な減少を示した変異体を示す（n ≥ 7, P < 0.05）。 (B) 野生型株UMH14と相補的tatC変異体（tatC/tatC+）の相対的な適応度。 7655>
ツインアルギニン転座システムの構成要素をコードするtatC遺伝子の変異は、試験したすべての変異体の中で最も大きなフィットネスの喪失をもたらした（図3）。 そこで、tatC遺伝子のオープンリーディングフレームを持つプラスミドpBBR1MCS-5をtatC変異体に導入し、遺伝的相補性によりこの変異体のフィットネスが回復するかどうかを調べたところ、tatC変異体のフィットネスが最も高かった。 その結果、tatC変異株は、野生株と競合して脾臓で67倍の適応度異常を示したが（図3A）、相補的なtatC変異株は同じ条件で2倍の適応度異常を示しただけであった（図3B）。 同様に、相補的なtatC変異体は、UMH14と比較して肝臓で有意な競合を示さなかった。 また、pBBR1MCS-5またはtatC+相補体プラスミドを保有するC. freundii tatC変異体のin vitro培養では、選択のない状態で24時間以上にわたってプラスミドが顕著に損失しないことが示された（図S5）。 7655>
Citrobacter分離株におけるフィットネス遺伝子の保存
本研究の過程で、各Citrobacter分離株の全ゲノム配列を決定し、UMH14を基準として各株の予測プロテオームを比較検討した。 UMH14染色体にコードされている4,666の予測遺伝子産物のうち、3,742は本研究のすべてのC. freundii分離株の間で95%以上の同一性で保存されていた(Fig. 4A)。 UMH17とUMH18の予測プロテオームを含めると、全株で保存されているタンパク質の数は2,545に減少し、多座配列解析によりこれらの株がC. freundiiの分岐の外に位置していることと矛盾しない（図1）。 UMH14の適合性因子の保存性も高く、予測された177個のタンパク質のうち145個が8つの菌血症株の間で95%以上のアミノ酸同一性で保存されており（図4B）、検証に選ばれた初期の適合性因子7個すべてを含んでいた（表1および図3）。 UMH17とUMH18を考慮から外すと、保存された適合性因子の数は162 (92%) に増加した。 これらの結果から、シトロバクターは菌血症時の生存戦略を、種内で保存されたタンパク質に大きく依存することが示唆された。 興味深いことに、このサブセットの菌株の中でUMH14に完全にユニークな（<30%の同一性）適合性因子はほとんどなかった。 1つの顕著な例は、推定3遺伝子オペロン（CUC46_23440-CUC46_23450）で、6倍から14倍の範囲のフィットネス欠陥が観察された。 3つのオープンリーディングフレームはすべて仮説的なタンパク質をコードしており、これらのうちCUC46_23450のみが機能が割り当てられた保存ドメインをコードしていると予測される（cd01713, phosphoadenosine phosphosulfate reductase）
8つのシトロバクター菌血症分離体のプロテオームを比較している。 (A) 本研究で収集したすべてのシトロバクター分離株の予測タンパク質配列を、PATRICウェブサーバーを用いて基準株UMH14の染色体およびプラスミドエンコード（p1およびp2）配列と比較した。 (B）177のC. freundiiフィットネスファクターのアミノ酸配列は、他のCitrobacter分離株内のホモログを同定するための参照として使用された。 アミノ酸配列の同一性のレベルは色で示されている。 外側から内側へのトラック：1, UMH14; 2, UMH13; 3, UMH15; 4, UMH16; 5, UMH19; 6, HM38; 7, UMH17; 8, UMH18.
DNA recombination and repair pathway
この研究の目的の1つは複数の菌血症適応因子に関わって保存されている生体経路を特定することだった． DNAの組換えと修復に関与するRecBCDとRuvABC酵素複合体は、そのような例を示している。 RecBCD酵素は二重鎖DNA末端で活性化し、相同組換えと組換えDNA修復のプロセスに必要である。 これらの機能に関連して、RuvABC酵素はホリデイジャンクション分岐の移動と解消を促進する30,31。 recB、recC、recDのいずれかにトランスポゾンを挿入すると、フィットネスが6-8倍低下し、同様にトランスポゾン挿入によるruvAとruvCの両方の破壊はフィットネスの>30倍損失をもたらした（Data S1）。 重要なことは、ruvAの適応度低下は、独自に構築した変異体を用いた野生型株に対する競合感染によって確認されたことである（Fig. 3A）。 2つの多タンパク質複合体の中で、RuvBだけが、我々のデータセットで有意な適合性因子として同定されなかった。 両タンパク質複合体は、通常の染色体合成時に発生する停止または崩壊したDNA複製分枝の解消に関与することが知られている30が、重要なことに、ruvA変異体はリッチ培地での迅速複製時に野生型株と同様に増殖した（Fig. S4）。 7655>
The twin-arginine translocation system
The twin-arginine translocation systemはグラム陰性細菌において、細胞質膜を越えて折り畳まれたタンパク質を分泌する機能を有している。 この保存された多タンパク質システムにおけるTatCの役割は、この経路で輸出されるタンパク質の分泌シグナル配列を認識することである。 C. freundiiのin vivoフィットネスにtatC遺伝子が大きな影響を与えることがわかったので（図3）、Tatシステムによって分泌されるタンパク質もマウスモデルでのフィットネスに必要であることが推論された。 Tat分泌タンパク質と思われるものを同定するために、177のフィットネスファクターのそれぞれのN末端配列をTatP 1.0予測ソフトウェア32を用いて解析した。 2つの遺伝子、CUC46_16565とCUC46_16060が、ツインアルギニンモチーフを含むTat依存性のシグナルペプチドをコードするものとして同定された。 CUC46_16565は大腸菌のSufIタンパク質と94%のアミノ酸同一性を持ち、シグナルペプチドのツインアルギニンモチーフと疎水性部分は100%保存されている33。 C. freundii sufI遺伝子を変異させ、UMH14親株との競合でフィットネスを評価し、TatCの喪失に伴うフィットネスの欠陥のいずれかがSufI機能の破壊に起因するかどうかを調べた(Fig.5A)。 実際、sufI変異株は野生株と比較して、脾臓で7倍、肝臓で17倍も競争に負けることがわかった。 しかし、tatC変異株の適応度コストは、野生型細菌との競合で67倍から112倍であったため（Fig. 3)、sufI変異のフィットネスコストが比較的低いことから、さらなるTat依存性基質もフィットネスに寄与している可能性が示唆された。 C. freundiiにおけるSufIのTat依存性分泌を確立する試みは、特にtatC変異株において、C末端FLAGエピチオープタグのSufI構築物の発現に伴う明らかな毒性の問題により成功しなかった（データは示されていない）。 しかし、SufIは、大腸菌のTatシステムを特徴付ける多くの研究において、モデルTat分泌タンパク質として使用されている。
推定Tat分泌タンパク質変異体の適性欠損およびC. freundii運動へのTatシステムの関与。 (A) C. freundii UMH14親株とsufIまたはpepP変異体の混合物（1：1）を用いて、尾静脈注射でマウスに共培養した。 24時間後に存在する野生型と変異型の菌数を用いて、脾臓（丸）および肝臓（四角）に生息する菌のCIを算出した。 相対的な適応度に変化がないことを示す1.0の仮想的なCIは点線で表されている。 アスタリスクは、Wilcoxon符号付き順位検定で決定された仮説値と比較して、中央値フィットネス（実線の横線）が統計的に有意に減少した変異体を示す（n ≥ 8, P < 0.05）。 (B) 野生型、tatC変異体、およびtatC変異体補体（tatC/tatC+）の遊泳運動量の定量化。 0.3%寒天で固めたLB培地に細菌を接種し、37℃で16時間培養した後の生育域の直径を測定することで遊泳運動を定量化した。 棒グラフは3枚プレートの平均値±標準偏差を表す。 tatC変異株は、t-testにより野生型および相補性変異株と比較して有意に運動性が低かった（アスタリスク、P < 0.001）。 (C)泳ぐ運動性を示す代表的な寒天プレート。
2番目に同定されたTat分泌フィットネス因子として、CUC496_16060がコードする、PepPスーパーファミリーに属するプロリン アミノペプチダーゼ（PRK10879）が予測される。 pepP遺伝子欠損変異株は、脾臓で約3倍、肝臓で約2倍競争したが、野生型と比較して観察された体力的不利は統計的に有意ではなかった(Fig. 5A)。 そこで、PepPの細胞内局在を、C末端FLAGエピトープタグの付いたマルチコピープラスミド（PepPFLAG）を用いて解析したところ、PepPの細胞内局在は、C末端FLAGエピトープタグの付いたプラスミド（PepPFLAG）により決定された。 しかし、PepPFLAG融合タンパク質は、両株とも主に細胞質画分に存在し（図S6）、Tat依存的なPepPタンパク質の細胞内局在を示す証拠は得られなかった。 これらのデータは、sufI変異体の競争感染の結果と合わせて、C. freundiiにはさらなるTat依存性のフィットネス因子が存在する、あるいはTatシステムを介したタンパク質輸送の累積損失が、任意の単一の基質の機能損失を上回るという考えをさらに支持するものである。 C. freundiiは、軟寒天マトリックス中で遊泳運動が可能な鞭毛虫細菌である。 C. freundiiのtatC変異体は、野生株と比較して遊泳運動性が約2倍低下しており、トランスでの遺伝子相補により遊泳運動性が完全に回復した（図5B,C）。 これらの結果は、TatCの機能がない場合の運動欠損を明確に示している。しかし、tatC変異体ではまだ低レベルの遊泳が観察されたため、何らかの鞭毛機能が保持されている可能性が高い。 また、FliQを除き、菌血中に同定された鞭毛関連フィットネス遺伝子の全般的な欠如は、C. freundiiフィットネスに対するtatCの重要性が、この株で観察された鞭毛機能障害とは大きく異なる可能性を示唆している。 中心炭素代謝（pfkA）、フルクトース・マンノース代謝（mtlD）、アミノ酸生合成（cysE）の構成要素を表す3種類の遺伝子がさらなる調査のために選択された。 細菌のシステイン生合成は、L-セリンから中間体O-アセチル-L-セリン（OAS）を経由して行われる。 モデル大腸菌の経路のこの最初のステップはCysE O-acetyltransferase酵素によって触媒され、cysEの損失はシステイン補助栄養となる38,39。 C. freundiiのcysE変異体も同様に、システインを欠く培地では複製できないが（Fig. 6A）、培地にOAS（Fig. 6B）またはシステイン（Fig. 6C）を補充すると野生型に近い密度を達成することができる。 cysE変異の遺伝的補完により、システイン非存在下での増殖が部分的に回復された。 興味深いことに、cysE変異体細菌がin vitroでOASまたはシステイン非存在下で完全に増殖しないことは、感染時に観察される部分的な適性の欠損とは対照的である（Fig. 3A）。 このことは、シトロバクターは血流環境からこれらの代謝物を得ることができるかもしれないが、それでも生合成経路の破壊に伴う適合性コストが存在することを示唆している。
C. freundii代謝変異体の規定培地での増殖。 野生型（WT）C. freundii株UMH14、ベクターコントロールプラスミドを保有する変異体、および相補性変異体をM9培地にて培養した。 細菌の増殖は、光学密度（600nm）により15分間隔で測定し、各ポイントは3連培養の平均値±標準偏差を表す。 基本的なM9塩類溶液には、以下のようにサプリメントを添加した。 (A) 22 mMグルコース；(B) 22 mMグルコースおよび10 mM OAS；(C) 22 mMグルコースおよび1 mMシステイン；(D) 22 mMグルコース；(E) 22 mMマンニトール；(F) 22 mMグルコース
シトロバクターのホスト関連の代謝に関する研究の一部として、異なるカーボンソースに対するこのバクテリアの能力を調査した。 他の腸内細菌種のPfkAホスホフルクトキナーゼ酵素は、解糖の最初のステップを表し、フルクトース-6-リン酸をフルクトース-1，6-ビスリン酸にリン酸化する触媒として、広範囲に特徴づけられてきた。 UMH14では、pfkAの変異により、グルコースを唯一の炭素源とするこの株の複製能力が失われた（図6D）。この能力は、pfkAをマルチコピープラスミドで提供することにより部分的に回復させることができた。 このin vitroでのグルコース利用能の完全な喪失は、菌血症の際の体力が2倍低下することと相関していた（Fig.3A）。 グルコースは哺乳類血清中の豊富な炭素源であることから40、これらの結果は感染時にシトロバクターがグルコースを利用する役割と一致するが、同時にシトロバクターの代謝レパートリーが代替炭素およびエネルギー源の利用を促進できることも示唆された
フルクトース-6-リン酸を含む第2の酵素活性もシトロバクター菌血症への寄与について調べた。 マンニトール-1-リン酸-5-デヒドロゲナーゼ蛋白質MtlDは、NAD+またはNADHを補酵素として、マンニトール-1-リン酸とフルクトース-6-リン酸の双方向変換を促進する41,42。 複数の腸内細菌種は、ヘキシトールホスホエノールピルビン酸依存性リン酸化酵素系を介して糖アルコールであるマンニトールを輸送後、唯一の炭素源として利用し、マンニトール-1-リン酸の細胞内蓄積をもたらす43,44。 マンニトール-1-リン酸は、MtlDによってフルクトース-6-リン酸に酸化され、解糖系に移行する可能性がある。 C. freundiiのmtlD変異体は、マウスの肝臓でのフィットネスが5倍低下した（図3A）。この観察から、C. freundiiがin vitroでこの種の代謝を行うことができるかどうかを調べる実験が行われた。 UMH14株とmtlD誘導体株をマンニトールを含む培地で培養し、得られた増殖曲線から、野生型細菌と相補性変異体はこの条件下で増殖できたが、mtlD株は増殖できなかった（Fig.6E）。 予想通り、mtlD変異体は好気的条件下で炭素源としてグルコースを供給されると、野生型に近いレベルまで増殖することができた（図6F）。 7655>
Shared fitness strategies among pathogens in the bloodstream environment
我々は以前、同様の菌血症モデルを用いて、別の日和見病原体であるS. marcescensの適合性要件を評価したことがある。 S. marcescensの研究結果には、今回と同様の手法で212のフィットネス遺伝子が同定されている45。 これらの種が BSI 時の適合性に関して共通の経路を持つかどうかを判断するため、まず両種の予測プロテオームが比較された。 C. freundiiとS. marcescensの間で、配列の50%以上で70%以上のアミノ酸の同一性を持つタンパク質をホモログとした。 その結果、42の相同タンパク質が両生物において重要な適応因子として同定され（表S1）、多くの多様な機能がこの共有適応因子のリストに表れていることが分かった。 特に、RuvAタンパク質は、その欠損により、競合感染によるC. freundiiのフィットネスが10倍減少した（図3A）が、RuvCとともにS. marcescensのフィットネスファクターとして同定された。 これらの結果は、ホリデイジャンクション複合体の解消が、DNA損傷の組換え修復の際に、これらの生物のin vivoでのフィットネスに重要である可能性をさらに支持するものであった。 また、PfkAホスホフルクトキナーゼ酵素も両種においてフィットネスファクターとして同定された。 S. marcescensのpfkAは、Citrobacterと同様に、グルコースを唯一の炭素源として利用するために必要であり、さらに熱不活性化ヒト血清中で最適な細菌複製を行うために必要であった45。 両生物において、pfkAはトランスポゾンスクリーンで評価したように脾臓での適性に寄与していたが、興味深いことに、S. marcescens pfkA変異体は野生型株との競合感染によって腎臓での適性を約9倍も低下させることも明らかにした。 この研究の過程で、C. freundii UMH14 野生型株は BSI モデルにおいて腎臓への定着が比較的悪いことが確認されたが、Proteus mirabilis の pfkA 遺伝子は尿路感染後の腎臓での適性に寄与することが示されている46。 これらの結果は、特定の環境下で生物間で保存された適応戦略を特定することが可能であることを示している。 今後、これらの遺伝子産物がBSIを引き起こす他の生物でも必要とされるかどうか、また、これらの保存された適応経路を利用できるかどうか、さらなる研究が必要である
。