Biol Res 41: 197-204, 2008
ARTICLE
Differences in lipogenesis and lipolysis in obese and nonobese adult human adipocytes
MARIANA CIFUENTES, CECILIA ALBALA and CECILIA V ROJAS
INTA, Universidad de Chile, Santiago, Chile.Institute of Nutrition and Food Technology (NTA), Universidad de Chile, Santiago, Chile.
通信欄
肥満者と痩せ型では脂肪細胞の機能や代謝に違いがあり、脂肪組織の機能異常が肥満における代謝障害につながることが提案されている。 我々は、肥満（OB）と非肥満（NOB）のヒトの卵巣脂肪細胞の脂肪生成と脂肪分解を研究した。 脂肪生成マーカー酵素G3PDHの比活性は、OBの総脂肪細胞ではNOBの被験者のそれに比べて50％低かった。 OB の Omental 脂肪細胞は、基礎脂肪分解活性も低く、p-adrenergic 刺激に対する脂肪分解反応も低値であった。 メチルβ-シクロデキストリンを用いた脂肪細胞形質膜のコレステロール枯渇は、両群の脂肪細胞に対して共に脂肪分解作用を引き起こしたが、肥満と痩せの被験者を別々に分析すると、その反応は肥満でのみ有意であった。 我々は、肥満者の卵巣脂肪細胞における異なる脂肪生成および脂肪分解プロファイルの証拠を提示し、OBとNOBの脂肪細胞脂肪分解におけるその除去の影響が異なる、細胞膜コレステロールの関連した役割を提案する。
キーワード：脂肪細胞、コレステロール、脂肪生成、脂肪分解、肥満、トリグリセリド代謝
はじめに
内臓脂肪組織の過剰は、多くの健康問題に関連している。 脂肪率の増大は、脂肪細胞の体積の増加と関連している。 そのため、肥満の人は痩せた人に比べて肥大化した脂肪細胞を多く持っている。 動物およびヒトの脂肪細胞に関する研究により、アディポカイン分泌および遺伝子発現プロファイルに加えて、インスリン感受性およびグルコース代謝など、脂肪細胞のいくつかの代謝機能が、細胞サイズが大きくなると変化することが立証されている（Bluherら、2004； SalansおよびDoherty、1971； Salansら、1974； Smith、1971； Yangら、2004）。 このことから、脂肪組織における肥大化した細胞および/または代謝障害細胞の機能的優位性が、脂肪組織の恒常性維持信号に対する低反応の重要な原因効果であり、したがって肥満状態を永続させるか悪化させるという提案がなされている。 この仮説を検証するために、我々は、OBとNOBの成人から単離した卵巣脂肪細胞におけるin vitroの脂肪生成と脂肪分解を研究することに着手した。 脂肪分解のシグナルはカベオラに存在するタンパク質に依存し、このコレステロールに富んだ構造の破壊が肥満脂肪細胞の代謝の変化と関連していることを考えると（Le Lay et al, 2004）、我々はまた、OBおよびNOB脂肪細胞の脂肪分解におけるメチル（β）-シクロデキストリン（M（βCD））を用いた細胞膜コレステロール除去の影響も評価した。 200>
材料と方法
脂肪細胞の単離
ヒト卵巣脂肪は、選択的腹部手術（胃バイパス、婦人科、胃腸のいずれか）を受けた肥満（OB）と非肥満（NOB）被験者25人から入手された。 被験者の年齢は29～79歳で、肥満度（BMI）は18～54kg/m2であった。 肥満を定義するカットオフ点は、BMI > 30 kg/m2というNIHの定義に従って検討された。 12名（男性9名、女性3名）はNOB（BMI 23.3 ± 3.4 kg/m2）であったが、13名はOB（BMI 38.2 ± 4.3 kg/m2、男性4名、女性9名）であった。 調査したパラメータに性別の影響は観察されなかった。 プロトコルはチリ大学INTAのInstitutional Review Boardにより承認され、ドナーからインフォームドコンセントが署名された。 手術中に摘出された脂肪組織は生理食塩水に浸漬され、1時間以内に処理されるよう実験室に運ばれた。 到着後、組織はHanks’ Balanced Salt Solution（HBSS）で数回洗浄し、目に見える結合組織、血餅、血管をすべて除去した後、小片（2〜3 mm2）にミンチし、抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン）を補充したMI99（Invitrogen, Carlsbad, CA）メディウムで37℃に制御した雰囲気培養器内で培養を行った。 ホルモン環境、現在の健康状態、投薬などの被験者要因による個人間変動を最小化するために、組織の培養期間は2日間とした。 脂肪細胞は、Rodbell (1964)の研究に基づく方法を用いて単離した。 簡単に言えば、ミンチした脂肪組織をlg/1コラゲナーゼタイプI（Worthington Biochemical Corp. Lakewood, NJ）とともに、37℃で60分間、連続的に混合しながらインキュベートした。 得られた細胞懸濁液を滅菌ガーゼで濾過し、脂肪細胞は水相から自然に分離するので、浮遊層をプラスティックピペットで穏やかに吸引して回収し、5容量のHBSSで2回洗浄した。 分離した脂肪細胞は、直ちに脂肪分解研究に使用するか、または後のグリセロール-β-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）測定のために凍結した。
β-アドレナリン刺激に対する脂肪分解反応性と脂肪生成活性の検出（下記参照）から、組織の消化後に生存脂肪細胞が存在していることが証明された。
脂肪生成と脂肪分解
脂肪細胞におけるトリグリセリドの合成は、既製の脂肪酸とde novoの両方を使用し、一方グリセロールバックボーンは、グルコース由来のグリセロール-β-リン酸に由来しています。 脂肪生成能力は、解糖により供給されるジヒドロキシアセトンリン酸からトリグリセリドのグリセロール骨格の生成を触媒する酵素G3PDHの特異的活性により評価された。 脂肪組織では、この酵素がグリセロールβ-リン酸の供給源であることから、脂肪組織におけるトリグリセリド合成の律速因子と考えられている。 成熟脂肪細胞における脂肪生成マーカーとしてのその使用は、インスリンによるそのmRNAと活性のアップレギュレーションによって裏付けられている (Moustaid et al., 1996; Rumberger et al., 2003)。 簡単に述べると、単離脂肪細胞を、0.25Mスクロース、lmM EDTA、50mMトリエタノールアミンおよびlmMジチオトレイトールを含む緩衝液中、4℃で、テフロン乳棒を備えたガラス管を用いてホモジナイズ（1800rpmで10ストローク、Glas-Colホモジナイザーシステム、Glas-Col、INを用いる）した。 ホモジネートを14,000 x g, 4°C, 30分間遠心分離した。 G3PDH活性は、KozakとJensen（1974）による方法に基づいて、酵素の基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を用いて、マイクロプレートリーダー（EL-808, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT）でNADH酸化（37℃で340nmの吸光度の変化のタイムコース）を測定し、上澄み液中にて測定した。 反応はアッセイ期間中、時間に対して直線的であった。 酵素活性の1単位は、上記に示した条件下で1分間に1nmolのNADHが酸化されることに相当する。 可溶性抽出物中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法（Bradford，1976）を用いて測定した。
脂肪分解は、48時間の脂肪培養の間、MI99培養メジウムに放出される累積グリセロールの測定により評価した（フリーグリセロール決定試薬、Sigma，St Louis MO）。 さらに、細胞膜コレステロールの枯渇（10mM MβCDによる60分間のプレインキュベーション）を伴うか伴わないβ-アドレナリン刺激に対する急性脂肪分解反応は、10％脂肪細胞懸濁液を37℃で穏やかに連続旋回させ、10μM イソプロテレノール（Sigma）またはビヒクルを添加して90分間インキュベートする間に放出される総グリセロールを測定することによって評価された。 脂肪組織培養中の脂肪分解評価では、グリセロール値を組織1mg当たりで表し、脂肪細胞懸濁液中の脂肪分解評価では、Carpéné（2001）の記載に従って、または脂肪分解剤を用いた実験では、それぞれの基底（非刺激）対照に対して値を正規化する。 細胞内脂質はDolé and Meinertz (1960)の方法で抽出し、重量法で測定した。 特に OB と NOB を比較した我々の研究では、交絡因子として作用する可能性のある細胞サイズと脂肪分解との独立した関係が報告されていることから、脂質 1 mg あたりの表現が最も適切であると考えられた。 Largeら(1999)が示したように、脂質量あたりで発現するグリセロールリラーゼは、肥満および痩せたヒト被験者の研究においてホルモン感受性リパーゼの活性と高い相関があり、肥満では脂肪細胞体積が増加するため、細胞数あたりよりも脂肪分解能に関連性が高い。
統計
平均値の差はStudentのt検定を用いて解析し、P=0.05で有意と見なした。 連続変数の関連性を評価するためにピアソンの相関係数を使用した。 データは平均値±SEMで表した。
結果
脂肪生成
脂肪生成酵素G3PDHの比活性は、NOBの脂肪細胞のそれに比べてOB被験者ではほぼ半分だった（p <0.05, Fig.1）。 これと一致して、脂肪生成マーカーと被験者のBMIの間には有意な逆相関が認められた（図1、挿入図、r2=0.31、p=0.01）。 これらの結果にバイアスを与える可能性のあるタンパク質濃度（G3PDH活性の正規化に使用）の差が、OBとNOBの被験者の間になかったことは注目に値する。
脂肪分解
全大腿骨脂肪組織または分離脂肪細胞の培養中のインキュベーションメジウムへのグリセロールの再放出は、脂肪分解活性の指標として使用された。 OB患者の単離脂肪細胞では，基底状態およびイソプロテレノール刺激による脂肪分解がともに低かった（それぞれp<0.05およびp<0.01，Fig.2）． これらの観察と一致して、組織全体（r2=0.46、p<0.0005、挿入図2）および単離脂肪細胞（基礎：r2=0.28、p<0.01、βアドレナリン刺激：r2=0.17、p<0.05、n=20）において脂肪分解と被験者のBMIの間に極めて有意な逆相関が存在することが確認された。 肥満被験者の脂肪細胞は、痩せた被験者の脂肪細胞と比較して、（β-adrenergic刺激に対する）低い応答を示した（図3、p<0.05）。
11サンプルのサブセットで脂肪細胞を10 mM MβCDに暴露すると、基礎脂肪分解が有意に増加した。 この増加は、被験者のBMIに正比例していた（r2=0.5、p<0.05、図4）。 脂肪細胞をM(βCDに暴露した場合、(β-adrenergic刺激に対する脂肪分解反応は著しく減少した（それぞれ345 ± 50 % vs 199 ± 33 %、p<0.05）。 興味深いことに、M(βCD)とビヒクルの効果を比較すると、BMI>40 kg/m2（NIHの定義による病的肥満）の被験者の脂肪細胞では、イソプロテレノールに対する脂肪分解反応の著しい減少が認められたが、痩せた被験者には有意差がなかった（図5）。 これと一致して、BMIと10 mM M(βCD) 存在下および非存在下での10 μM isoproterenolに対する脂肪分解反応の比率の間に有意な相関が認められた（r2=0.46、p<0.05）。
考察
今回、我々は幅広いBMI範囲（18～54kg/m2）のOBおよびNOB成人の大腿脂肪組織から分離した脂肪細胞における脂肪生成および脂肪分解を研究した。 その結果、OBにおける脂肪生成マーカーG3PDHの比活性は、NOBの同胞の脂肪細胞における比活性の半分であることがわかった。 一方、高いBMIは、基礎および（β-アドレナリン刺激）脂肪分解の低下と関連し、コレステロール除去による細胞膜シグナル伝達障害に対する感受性がより高かった。 OB脂肪細胞におけるより大きなトリグリセリド蓄積は、他の者も提案しているように、このグループで観察された低い脂肪分解活性に関連しているのかもしれない（Langinら、2005年）。 さらに、OBで見出された低いG3PDH特異的活性は、直感に反するかもしれないが、過剰な循環トリグリセリドを貯蔵する能力の低下を表している可能性があり、高トリグリセリド血症と体の他の部位への脂肪蓄積を引き起こし、メタボリック症候群に伴う周知の有害な影響をもたらす可能性がある。
ヒトのin vivoアプローチを使用して、Dodtら（2003）は、肥満の女性における神経内刺激に対する脂肪分解反応の鈍化を観察し、これは、我々のin vitro結果と一致し、肥満が、交感神経活性化に対する低い脂肪分解反応と少なくとも部分的に関連しているかもしれないという概念を支持するものであった。 また、Gómez-Ambrosiら（2004）は、卵巣脂肪組織の遺伝子発現パターンを研究し、肥満の被験者は脂肪分解誘導遺伝子と抑制遺伝子の発現がそれぞれ低下と亢進していることを示した
脂肪分解データの正常化に関する文献にはかなりの食い違いがある。 脂肪細胞の大きさと脂肪分解の直接的な関係 (Large et al., 1999) が報告されており、肥満者ではより大きな脂肪細胞が相対的に多く存在する (Large et al., 1999) ことを考えると、脂肪組織は、肥満者では健常者よりも未調整の脂肪分解を大きく示すと予想される。 そこで、OBとNOBの細胞サイズ分布の違いによる交絡因子を避けるため、グリセロールリラーゼ値を総脂質量mgあたりで表現して正規化し、ある脂質量に対する脂肪分解活性を評価することにした。 これを裏付けるように、肥満および痩せたヒトの研究では、主要な脂肪分解酵素であるHSL（ホルモン感受性ウパーゼ）の活性と、脂質量あたりで表した脂肪細胞のグリセロールリラーゼとの間に高い相関関係が観察されている（Largeら、1999）。 著者らは、肥満者では脂肪細胞の体積が増加するため、細胞数あたりの正規化よりも脂質量の方が脂肪分解能に関連すると述べている。 基底状態でのβ-アドレナリン刺激もOB被験者では低いことが証明され、この評価は、対応する対照（各基底値）で正規化されることを考えると、細胞のサイズまたは数に依存しないことは注目に値する。
カベオレの完全性、特定のシグナル伝達および適切な細胞機能に対する膜コレステロール量の役割は、すでに認められている (Le Lay et al. 2001)。 肥大化した脂肪細胞は、細胞膜コレステロール含量の低下とともに、代謝が損なわれていることが示されています (Le Lay et al. 2001)。 我々の観察は、Le Layらによるものを拡張するものである。 (2001, 2004)は、脂肪細胞におけるコレステロールの枯渇がインスリン抵抗性を誘発し、脂肪代謝に関連する多くの遺伝子の発現を変化させることを示した。 これらの結果は、脂肪細胞の肥大化と代謝障害の関連として、細胞膜におけるコレステロールの減少を示す証拠として提供されたものであり、今回の結果もこれを支持するものである。 脂肪細胞をM(βCD)に暴露した実験では、基礎的な脂肪分解が著しく増加し（細胞膜カベオレの完全性が変化し、phosphodiesterase 3B活性が低下した後に予想される）、その結果、（β）アドレナリン刺激に対する脂肪分解応答が減少することが判明した。 興味深いことに、M(βCD)の基礎脂肪分解への影響とBMIとの間に有意な関連が観察された。 さらに、M(βCD)の存在下および非存在下におけるBMIと基礎脂肪分解に対するイソプロテレノールの比率との間の有意な相関は、肥満被験者の脂肪細胞がコレステロール枯渇駆動型細胞膜変化シグナルに対してより感受性が高いことを支持するものである。 2003）はインスリン抵抗性であり（Olefsky 1977）、肥満関連疾患に関連する明確な分泌パターンを示す（Imbaultら、1999；Van Harmelenら、2000）。 2004）は、脂肪細胞の小細胞（直径＜4638＞50μm）と大細胞（直径＜7051＞1OOμm）の2つの亜集団への偏光を示し、これは、他のパラメーターの中でもトリグリセリド合成および脂肪分解における差異を伴っている。 今回報告された観察結果は、OBとNOBの被験者の卵巣脂肪細胞間のトリグリセリド代謝における本質的な違いを示しており、肥大化し膜コレステロールを失った脂肪細胞の濃縮が、そうした変化を促進している可能性を提案するものである。 脂肪分解反応の障害は、やがてトリグリセリドデポの肥大化に寄与する可能性がある。 200>
我々の知る限り、ヒトのOBとNOBの被験者の卵巣脂肪細胞における脂肪生成と脂肪分解を評価した研究は他にない。 本研究では、非肥満者と比較して肥満者の卵巣脂肪細胞におけるトリグリセリド代謝に関連した差異を示し、肥満者の脂肪細胞は細胞膜のコレステロール含有量の減少の影響を受けやすいことを示唆した。 被験者の要因を最小限にすることを意図したとはいえ、肥満被験者に存在する併存疾患が、脂肪細胞の異なる挙動に影響を与えている可能性は否定できない。 これらのグループ間と、このような病原性に関連する脂肪層におけるトリグリセリドの取り扱いを比較することは、代謝と反応性の違いを理解するのに役立ち、これらは薬理学的介入のターゲットとなる可能性があり、さらなる研究が必要である。
謝辞
Tisné 病院の Miguel A. Celis 博士、DIPRECA 病院の Leonardo Rodríguez 博士、Padre Hurtado 病院の Cristian Cavalla、 James Hamilton、 Gonzalo Wiedmaier 博士には脂肪組織の入手において貴重な助言をいただき、また Mrs. 200>
GRANT SUPPORT
Supported by DI-U de Chile (N°s Mult 04/06-2 to C. Rojas and 1-04/01-2 to M. Cifuentes), and FONDECYT (N° 1070632 to C. Cifuentes)助成金(D.A.)。 C. Rojas, N°1080232 to M. Cifuentes）。
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