小曜散の海馬神経保護作用による認知能力改善効果

要旨

小曜散は漢方薬であり、その煎じ薬は海馬の神経を保護し、認知能力を改善する。 本研究は、卵巣摘出ラットにおけるXYSの認知能力への影響とその基礎的な機序を検討することを目的とした。 雌のSprague-Dawleyラットを卵巣摘出し、XYS（3 g/kgまたは9 g/kg）を経口投与した。陽性薬物対照として17-βエストラジオール（E2、2 μg/kg）を皮下投与し、プラセボ対照として1 ml食塩水（0.9%）の経口投与とした。 6週間の投与後、ラットはMorris水迷路試験で調べられた。 血清および海馬中のエストラジオール濃度はELISA法により測定した。 海馬の神経細胞の形態を観察するためにゴルジ染色を行った。 海馬の細胞のアポトーシスはTUNEL染色で観察した。 海馬CA1領域におけるN-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) 2Aおよび2Bのタンパク質含有量をWestern blotおよび免疫組織化学により測定した。 エストロゲン受容体（ER）およびPI3Kシグナルの発現は、ウェスタンブロットにより検出した。 卵巣摘出ラットでは、偽薬投与群と比較して、学習・記憶ともに障害された。 E2または高用量XYSを投与したラットは、生理食塩水投与ラットと比較して、学習および記憶によい結果を示した。 高用量XYSは空間獲得試行における逃避潜時を有意に減少させ、一方、空間プローブ試行におけるプローブ四分円の交差時間と持続時間を増加させた。 高用量XYSは海馬でのE2成分のde novo合成を促進したが、血清E2レベルには有意な影響を与えなかった。 ゴルジ体染色により、高用量XYSは海馬CA1領域の樹状突起スパインの枝数および密度を増加させることが示された。 TUNEL染色により、高用量XYSは卵巣摘出術による神経細胞のアポトーシスを緩和することが示された。 海馬CA1におけるNMDAR2AおよびNMDAR2Bの発現量はXYS投与により上昇した。 XYSの有益な効果は、ERα-PI3Kシグナルを活性化することによるものであった。 結論として，XYSの大量投与は海馬ニューロンの保護と海馬E2レベルの回復により，卵巣摘出ラットの認知能力を向上させることができた

1. はじめに

更年期女性はエストロゲンレベルの変動に関連した不安や抑うつに悩まされることが多い。 また、不安や抑うつに加え、物忘れも更年期女性によく見られる症状である。 シアトル中年女性健康調査では、中年女性の6割が記憶力の低下を指摘したと報告されています。 The Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) は、更年期が中年女性の自己申告による物忘れの従属危険因子であることを明らかにした。 脳はエストロゲン調節の重要な標的であるため、エストロゲン欠乏が認知障害に関与していると推測される。 しかし、認知への影響に関する観察研究の結果は完全には一致していない . さらに、認知能力を改善するための効果的な治療的なホルモン介入はまだ確立されていない . さらに、知覚されたストレス、気分、身体的健康など、他の要因も記憶症状に寄与している可能性がある . 卵巣エストロゲン産生は、自然な移行ではなく、急激な減少の場合に記憶に影響を与える可能性がより高い . ヒトの研究での矛盾とは逆に、卵巣摘出動物での知見は、エストロゲン欠乏と認知機能の変化との関連やホルモン補充療法の効率性を支持している。

植物性エストロゲンの補給は、更年期の症状を緩和する人気のある代替療法である。 フラボノイド、イソフラボン、リグナンなどの植物性エストロゲンは、ステロイド性エストロゲンと似た構造を持ち、エストロゲン受容体（ER）を活性化することでエストロゲン様作用を発揮することができるのです。 メタアナリシスでは、大豆イソフラボンの補給が、閉経後の健康な女性の視覚記憶を改善する効果があることが支持されました。 SWAN Phytoestrogen Ancillary Studyでは、イソフラボンまたはリグニンの高摂取により、更年期のある段階において処理速度または言語記憶を改善することが示されたが、その効果は民族・人種にも関係していた … 植物性エストロゲンの認知機能改善効果は、動物実験においてより明らかに示されている。 フェヌグリークの種子の水中アルコール抽出物は、卵巣摘出術（OVX-）によって誘発された海馬のニューロン損傷を減衰させ、ラットモデルにおいて学習・記憶能力を改善することができました。

小夜散（XYS）は、中国語で幸せと気楽な粉という意味で、更年期の不安や鬱の治療に使われる漢方処方（TCM）です。 ブプレリ根（Chaihu）、アンジェリカ根（Danggui）、Paeoniae radix alba（Baishao）、Atractylodis rhizome macrocephalae（Baizhu）、Poria cocos（Fuling）、Zingiberis siccatum rhizoma（Shengjiang）、Menthae haplocalycis（Boe）およびGlycyrrhizae radix（Gancao）からなる処方であります。 26の無作為化試験を含む系統的分析により、XYSはハミルトンうつ病スケールスコアで示される抗うつ薬よりも優れており、自己評価式うつ病スケールスコアの改善において抗うつ薬の効果を高めることができることが示された。 更年期の女性で、眼精疲労や動悸がある場合にも、XYSの投与が有効である可能性がある。 更年期症候群を緩和するXYSの治療作用のいくつかは、植物性エストロゲンの存在に起因している可能性がある。 多くの研究が、XYSに植物性エストロゲンが含まれていることを報告しています。 エルゴステロールはPoria cocos（Fuling）に、β-sitosterolはAngelicae radix（Danggui）に存在することが知られている。 Miller-Mariniらは、複雑な中医学処方中の植物性エストロゲンの存在を検出するために、エストロゲンキメラ受容体/Gal4-応答要素制御/ルシフェラーゼレポーターアッセイを開発しました。 彼らは、同じ主要ハーブを使用したXYSの修正処方であるBupleurum & Peony Formulaを分析し、測定可能な植物性エストロゲンの含有量を見つけました。

XYSに植物性エストロゲンが存在することは、XYSがエストロゲン不足によって起こる認知障害を治療する可能性を示唆しています。 動物実験では、XYSが慢性不動ストレス（CIS）誘発の学習・記憶障害を減弱させることが示された . 現在のところ、更年期女性におけるXYSの認知機能障害改善効果について評価した研究はない。 そこで、本研究では、更年期ラットを用いて、XYSの認知能力に対する効果とその基礎的なメカニズムを検討した。 動物および処置

この研究では、合計60匹の雌のSprague-Dawleyラットが使用されました。 研究プロトコルは、実験動物施設倫理委員会の承認を得た（承認番号：ACU170802）。 動物は、温度と湿度を制御した条件下で、水と標準食に自由にアクセスできるように飼育された。 ラットは無作為に5つのグループ（12匹/グループ）に分けられた：Shamグループ、OVX＋生理食塩水またはO-salineグループ、OVX＋17-βエストラジオール（E2）またはO-E2グループ、OVX＋XYS 9 g/kgまたはO-XYS9グループ、OVX＋XYS 3 g/kgまたはO-XYS3グループであった。 ラットは麻酔下でOVX手術を受けた。 簡単に言うと、体幹の3分の1の部分と背骨の両側から1-2cm離れたところに縦方向の切開を行った。 脂肪組織はピンセットで静かに引き抜かれた。 卵巣が確認され、子宮角が結紮された。 卵巣を摘出し、腹部切開部を縫合した。 4087>

治療はOVX手術の2週間後に開始し、6週間継続した。 XYS投与群のラットにはXYSを1日9g/kgまたは3g/kgの単回投与で経管投与した。 陽性薬物対照としてE2（2μg/kg）の皮下注射を設定した。 プラセボ対照として1 mlの生理食塩水（0.9%）を経口投与した。 XYS煎じ薬は、南京中医薬大学附属病院から提供されたエキス（1g/ml、1g生薬/mlに相当）を使用した。 XYSの煎じ薬の処方は、事前に報告されている。 更年期女性に用いるXYSの投与量は、生薬175g/60kgで、ラットでは3.5g/kgに相当する。 他のラットモデル実験報告も参考に、低用量は3g/kg、高用量は9g/kgとした。 E2粉末（Cat.No.E2758, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）を少量のエタノールに溶解し、0.9%食塩水で20μg/mlのストッキング液を調製した。 モリス水迷路試験

ラットの学習・記憶機能をモリス水迷路試験(MWM)を用いて評価した。 MWM実験装置は直径200cmの円形プールで、高さ38～40cmの水を張ったものである。 水温は20〜22℃に一定に保たれている。 WMWテストは3つのパート、すなわち空間獲得トライアル（5日間）、空間プローブトライアル、可視プラットフォームトライアルから構成されている。 空間獲得試行では、ラットは水槽のランダムな象限に静かに置かれ、プラットフォームは水面下の北東象限に1.5cm隠されていた。 各ラットは最大60秒間泳いでプラットフォームを見つけることができた。 60秒以内にプラットフォームを見つけられなかったラットはプラットフォームまで誘導し、逃避潜時を60秒として記録した。逃避潜時はビデオ解析システム(ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA)によって記録された。 ラットは1日4回訓練した。 5日間の訓練後、ラットは北東四分円からプラットフォームを取り除いた空間プローブ試行を受けた。 ラットは北西の四分円の同じスタート地点に置かれた。 120秒間にプラットフォームを探すラットの移動軌跡が記録された。 120秒間にラットがプラットフォームを探した移動軌跡を記録し、目標地点での移動時間および交差時間を算出して空間記憶の保持を評価した。 空間プローブ試行の翌日には、水面から1.5 cmの高さのプラットフォームを南西に設置し、hidden platform訓練と同様のvisible platform試行を行った。 各ラットは4回解放され、毎回異なる入水点から解放された。 脱出潜時、遊泳距離、遊泳速度が記録された

2.3. 試料採取

MWM試験終了後、ペントバルビタールナトリウム(40mg/kg、腹腔内注射)による麻酔下でラットを開胸し、左心室経由で上行大動脈に挿管した。 E2検出のため、血清分離チューブを用いて体幹血を採取した。 6匹のラットの海馬を大脳皮質とその周辺の脳組織から分離し、素早く取り出し、冷PBSで洗浄し、液体窒素で凍結してE2の検出とウェスタンブロットに使用した。 3個の未灌流脳組織を4％パラホルムアルデヒドで24時間固定し、ゴルジ体染色と免疫組織化学に使用した。 左3匹のラットを冷生理食塩水で経心的に灌流した後、4%パラホルムアルデヒドで1時間固定した。その後脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで24時間固定し、TUNEL染色用にパラフィンに埋め込んだ

2.4. E2 Detection

血液サンプルは室温で凝固させ、4℃で15分間遠心分離して血清を分離した。 海馬の組織は重量を測定し、冷たい生理食塩水でホモジナイズし、20分間遠心分離して上清を採取した。 血清および海馬ホモジネート上清中のE2含量はELISAキット（上海酵素結合生物工学有限公司、上海、中国）により検出した

2.5. ゴルジ体染色＜5495＞＜6200＞海馬を小ブロックに切断し、記載した方法でゴルジ体染色を行った。 海馬のブロックをゴルジ体染色液(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China)に14日間浸し、その間、2-3日ごとに染色液を交換した。 組織は30%ショ糖で脱水し、100μmで切片化した。 切片はエタノールで脱水し、キシレンで透明化した後、ゼラチンを塗布したスライドにマウントした。 ゴルジ体染色はすべての試料で成功裏に行われた。 海馬の神経細胞の形態は、光学顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）で観察した。 海馬のCA1領域の神経細胞は、Image JソフトウェアのNeuron J pluggedを使用して解析した。 各ラットについて5つの切片を選択し、各切片について完全な形態を持つ樹状突起を選択した。 また、樹状突起の密度と分岐点を測定した

2.6. 免疫組織化学

海馬におけるN-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) サブユニット2Aおよび2Bの発現は、標準手順に従い、免疫組織化学によって決定された。 一次抗体はウサギ抗 NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, China) およびウサギ抗 NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China) を使用した。 二次抗体はHRP標識抗ウサギIgG（Servicebio社製）を用いた。

2.7. TUNEL染色

海馬の形態変化を市販のキット（Roche, Mannheim, Germany）を用いて指示通りにTUNEL染色で検出した。 切片はDAB発色反応後、ヘマトキシリン染色を行った。 TUNEL陽性のアポトーシス細胞の核は、光学顕微鏡で褐色に観察された。 各ラットについて5つの切片を選択し、各切片について3つの非反復視野（倍率400倍）を選択した。 全細胞におけるTUNEL陽性細胞の割合を算出した。

2.8. Western Blot

海馬CA1脳部を迅速に抽出し、brain Atlasに従って小切片に切断した。 海馬組織をRIPA溶解バッファー（100 Mm PMSFを含む、Servicebioから購入）と共に一晩インキュベートした。 細胞残渣を10分間遠心分離して除去し、タンパク質を含む上清を回収した。 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて、タンパク質濃度を測定した。 タンパク質ライセート（30μg/レーン）を10％SDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンにエレクトロブロッティングした。 5％無脂肪乳でブロックした後、膜を以下の一次抗体で一晩プローブした：ウサギ抗NMDAR2A（1：500、ミリポア、ビレリカ、米国）、ウサギ抗NMDAR2B（1：2000、ミリポア）、ウサギ抗CYP19（1：1000、エイビカム、ケンブリッジ、英国）、ウサギ抗ERα（1 : 2000、Millipore）、ウサギ抗ホスホ-ERα（Ser118、1 : 2000、Millipore）、ウサギ抗ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）110β（1 : 1000、Millipore）、ウサギ抗Bax（1 : 1000、Abcam）、ウサギ抗Bcl-2（1 : 1000、Abcam）およびウサギ抗GAPDH（1 : 1000、Biovorld Technology、ルイスパーク、MN、米国）。 GAPDHは内部コントロールとして検出した。 その後、2次西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ウサギIgG（1 : 5000, Bioworld）で1.5時間プローブし、バンドを化学発光法で可視化した。 タンパク質バンドの平均光学密度は、Image J ソフトウェアによって定量化した。

2.9. 統計解析

実験データはGraphPad Prism 5ソフトウェア（San Diego, CA, USA）により解析された。 数値データは平均値±SDで表した。 2群間の差はt-検定で比較した。 隠れプラットフォーム試験の結果は、群×日の反復測定ANOVAに続いてTukeyのポストホックによって分析した。 その他の多重比較は一元配置分散分析、Tukey’s post hocで解析した。 小羊酸煎は卵巣摘出ラットの空間学習・記憶能力を改善する

学習能力は、まず空間獲得試験を用いて評価した。 反復測定ANOVAにより、治療と訓練日の両方が逃避潜時に影響を与えることが示された（図1（a））。 全群で訓練日数の増加とともに逃避潜時が減少し()、各群内での潜時の減少傾向にも有意差が認められた。 また、処置と訓練日数の間に交互作用は見られなかった()。 トレーニングの最初の2日間は、各群の逃避潜時に有意な差は認められなかった。 訓練3日目から、逃避潜時は偽薬群より有意に長くなった。E2および高用量XYS9投与群の逃避潜時は生理食塩水群より短かったが、偽薬群との差はなかった。 5日間の訓練後、ラットは空間記憶をテストするためのプローブトライアルで評価された。 図1(b)に示すように、生理食塩水投与群では、交差時間、持続時間、probe quadrantにおける持続時間割合が有意に減少した。 他の象限での継続時間には差が見られなかった。 XYSまたはE2投与により、probe象限での交差時間および持続時間をsham群に比べ有意に回復させることができた。 空間学習・記憶に対する環境因子や実験動物の認知・活動レベルの影響を排除するために、ラットは可視プラットフォーム試験も受けた（図1（c））。 その結果、逃避潜時、遊泳距離、遊泳速度に群間で有意差は見られなかった。 これらの結果から、OVXラットでは空間学習・記憶が損なわれており、XYSの大量投与は損なわれた認知機能を効果的に改善できることが示唆された。

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3.2. 小羊酸煎は卵巣摘出ラットの海馬エストロゲン量を増加させる

次に、OVXラットのエストロゲン量に対するXYSの効果を検討した。 図2（a）に示すように、XYS投与はOVXにより減少した血清エストラジオールレベルを改善しなかったが、血清エストラジオールレベルには偽薬投与群とOVX投与群の間に有意差はなかった。 注目すべきは、高用量のXYSとE2は生理食塩水と比較して海馬のエストラジオールレベルを上昇させたことである（図2(b)）。 O-XYS3群では、依然として海馬のエストラジオールレベルは偽薬群より低かった。 海馬のE2量の変化は生殖腺由来のE2量の変化ではなく、in situ合成の変化で説明できる可能性がある。 そこで、エストロゲン合成の最終酵素であるCYP19の海馬での発現を検出しました。 その結果、XYSまたはE2投与により、生理食塩水投与群に比べCYP19の発現を増加させることができたが（）、高用量XYS群と生理食塩水群の差のみが有意であった（）。 投与してもCYP19の発現量を偽薬群に回復させることはできなかった。 この結果は、XYSが海馬におけるアロマターゼの発現を促進し、E2のde novo合成を増加させたことを示唆している。

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図2

XiaOの効果Yao-San（XYS）のエストラジオール合成への影響。 血清(a)と海馬(b)のエストラジオール含量。 (c-d) 海馬におけるチトクロームP450アロマターゼ（CYP19）の相対的発現。対偽薬、対偽薬、対O-saline。 各群の結果は12匹の平均データを表す。

3.3. 小羊酸煎は卵巣摘出ラットの海馬の神経細胞障害を軽減する

海馬の細胞形態、特にCA1領域は認知能力に重要な役割を果たす． 図3（a）に示すように、海馬の細胞形態をゴルジ体染色で解析した。 生理食塩水投与群では、偽薬投与群に比べ、神経細胞数が著しく減少し、樹状突起スパインの形態が損なわれていた。 さらにCA1ニューロンの解析を行ったところ、生理食塩水群ではニューロンの点数および樹状突起スパインの密度が有意に減少した（図3（b）、図3（c））。 高用量XYS投与は海馬のニューロン数を増加させ、CA1領域のニューロン点数およびスパイン密度を上昇させた。 E2投与は高用量XYSと同様の治療効果を示した。 しかし、低用量XYSは海馬CA1領域の神経細胞障害を効果的に改善することはできなかった。 海馬（CA1, CA3, DG）ニューロンのアポトーシスは、高用量XYSまたはE2処理により一貫して減少した（図4）。 しかし、低用量XYSはCA3ニューロンのアポトーシスを減少させるだけで、CA1およびDGニューロンには影響を与えなかった。 以上のことから、高用量XYSは海馬の神経細胞障害、特にCA1領域の神経細胞障害を軽減することができた。

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卵巣摘出ラットにおいて小羊酸煎は海馬のNMDAR2AおよびNMDAR2Bの発現を増加させた。

シナプス可塑性は長期学習および記憶の神経生物学的基盤であり、MWMテストのパフォーマンスはNMDAR機能により影響を受ける …。 そこで、海馬CA1におけるNMDARサブユニット2Aおよび2Bの発現をさらに推定した。 ウェスタンブロット（図5（a）および図5（b））により、OVXラットではNMDAR2AおよびNMDAR2Bの発現が減少していることが示された。 XYSまたはE2を投与すると、これら2つのタンパク質の発現レベルが有意に上昇し、偽薬群と同レベルになった。 免疫組織化学（図5（c））でも、治療群で陽性染色細胞の割合が増加した。 生理食塩水群と比較して、高用量XYSは、NDMAR2AおよびNDMAR2Bの両方の発現を有意に増加させたが（および0.013、それぞれ）、低用量XYSは、NMDAR2Aの発現のみを有意に増加させることができた（）。

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3.4. 小羊酸煎はERαを介してPI3Kシグナル経路を活性化する

E2や植物性エストロゲンが生理に与える影響はERシグナルによって媒介される。 研究により、マイトジェン活性化プロテインキナーゼであるextracellular signal-regulated kinase (ERK) の活性化が、E2による記憶への有益な効果に必要であることが示された 。 ERK1/2 のリン酸化は、PI3K の活性化に依存している . そこで、ER-PI3Kシグナルに対するXYSの影響を調べた。 図6に示すように、高用量のXYSおよびE2は、生理食塩水群と比較して、ERα、リン酸化ERα（Ser118）、およびPI3K p110（触媒サブユニット）の発現を著しく促進させた。 ERα-PI3Kの活性化は、さらに、プロアポトーシス因子Baxの発現を低下させ、抗アポトーシス因子Bcl-2の発現を亢進させることが確認された。 しかし、低用量XYSはERα-PI3Kシグナルに有意な影響を与えず、これは図3および図4の結果と一致する。

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