デオキシヌクレオチド三リン酸塩とバッファ成分

デオキシヌクレオチド三リン酸塩(dNTPs)は核酸分子の必須構成単位で、これがなければ新しい(増幅された)DNAを生成できないため、PCRミックスの必須成分となっています。 DNA配列を構成する4つの個々のデオキシヌクレオチド(すなわち デオキシアデノシン三リン酸、dATP; デオキシチミジン三リン酸、dTTP; デオキシシトシン三リン酸、dCTP。 デオキシグアノシン三リン酸、dGTP)は、通常、PCRおよびRT-PCRミックスに等モル量で添加されるが、PCR増幅される標的DNA配列が主にdATP/dTTP(AT比)または主にdGTP/DCTP(GC比)からなる場合、この不均衡を考慮し、PCRミクスのdNTPのモル比を変更することが可能である。 dNTPは通常、市販のサプライヤー(Roche、Promegaなど)から単品または(等モル)混合物として購入し、-20℃の弱アルカリ性水溶液中で保存すると化学的に安定である。 しかし、dNTPは溶液中では当然酸性であることに留意すべきである。したがって、作業溶液およびストック溶液は、長期保存の前にアルカリ性化合物で中和する必要があるかもしれない。 中和したdNTP溶液は、通常、分光光度計で10mMのストック溶液に調整するか、化学合成後の凍結乾燥品に直接、正しい量の滅菌水を加えて調整する。 一部のPCRでは、0.9%未満のデオキシヌクレオチド二リン酸(dNDP)を含み、>99%純粋で、修飾ヌクレオチドやテトラピロリン酸のような汚染物質を含まない高精製「PCRグレード」dNTP(Roche社)の使用により利益を得ることができる。 これらの(より高価な)高純度dNTPは、ターゲットDNAの非常に低いコピー数を含む調製物からPCR DNAをうまく増幅するのに役立つと思われます。

いくつかのPCRアプリケーションおよびプロトコルにおいて、4つのdNTPのうちの1つは、類似の、dNTP、例えばイノシン、7-デアザ-2′-デオキシグアノシン、または修飾dNTP、例えばビオチン、蛍光剤または放射性標識dNTPによって置き換えられるかもしれない。 このような修飾により、さらに下流のPCR後の処理アプリケーションを実行することができます

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