Introduction
サラセミアは東南アジアで最も多い遺伝性血液疾患で、ヘモグロビン（Hb）のグロビン鎖の合成が減少または欠如し、グロビン鎖のバランスが悪くなることによって起こります。1,2 βサラセミアは、11番染色体上のβグロビン遺伝子（HBB）の変異により発症するサラセミアの主要な型の一つです。 タイでは、βサラセミアとヘモグロビンE（HbE）の両方が、特にタイ東北部に分布する最も一般的な型の一つとなっています。 5,6
サラセミアの分子基盤は、世界中で研究されています。 300以上の異なるβ-グロビン遺伝子変異が特徴づけられている。 βサラセミア変異のほとんどは、コーディング領域とエクソン-イントロン接合部内の点変異、小さな欠失または挿入によって引き起こされる。 タイでは、βサラセミアのキャリアの有病率は3％～9％です。10 現在までに、30種類以上の変異が同定されています。11-13 変異が不均一なため、一部のβサラセミア患者の変異を特定することが困難になっています。 βグロビン遺伝子変異の同定には、ドットブロット解析、リバースドットブロット、増幅不応性突然変異システム（ARMS）を用いた対立遺伝子特異的増幅、あるいは直接DNA配列決定などの様々なDNA解析技術が広く用いられてきました14。-17
本研究では、タイ全土、特に中部からのサラセミア患者を対象とした3次医療センターであるプラモンクットクラオ病院で経過観察を行ったβサラセミア変異を有する小児患者80人のβグロビン遺伝子変異の特徴を明らかにすることを目的としました。
患者および方法
患者選択
2013年1月から2013年12月にタイ・バンコクのプラモンクットクラオ病院小児科の血液内科に通院した血縁関係のないβサラセミア患者80人を本研究に登録した。 研究プロトコルは、タイ・バンコクのプラモンクットクラオ病院、プラモンクットクラオ医科大学の施設審査委員会の承認を得ている。 65名の患者が臨床的にβサラセミアを発症しており、そのうち57名がβサラセミア/HbE、8名がホモ接合体または複合ヘテロ接合体のβサラセミアであった。 15人の患者がヘテロ接合性βサラセミアを有していた。 すべての患者は18歳以下で診断された。 ホモ接合型βサラセミアとβサラセミア/HbEを持つ患者は、先に述べたように、発症時の年齢、定常状態での平均Hb値、輸血回数歴などの基準に基づいて、臨床的に重症輸血依存性サラセミア大と軽度TIに分類した18
変異解析
インフォームドコンセントが得られた後、すべての人から合計80個の末梢血EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）試料が採取された。 AxyPrep™ blood genomic DNA miniprep kitを用い、製造元のプロトコールに従って末梢血リンパ球からゲノムDNAを抽出した。 ベータグロビン遺伝子変異は、まず2セットのアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または多重増幅不応性突然変異システム（M-ARMS）を用いて特徴づけられ、コドン41/42（-TCTT）を含む中国人と東南アジア人集団に共通する7つの突然変異が検出された。 コドン17（A>T）、ヌクレオチド-28（A>G）、IVS-II-654（C>T）、コドン71/72（+A）、IVS-I-1（G>T）、IVS-I-5（G>C）については既報通り。15,17 これらの変異は、この領域のβサラセミア対立遺伝子の80％～90％の原因であることが判明している19,20。 未知のβサラセミア遺伝子はさらに、以前に他の場所で説明したプロトコルに従って、βグロビン遺伝子の珍しい点突然変異や小さな再配列を検出するために、すべてのコード領域とエクソン-イントロンの境界のDNA配列を直接決定することによって特徴づけられた16。 上記のM-ARMSとDNA塩基配列の決定法で未解決のβサラセミアアレルを、ギャップPCRでスクリーニングし、タイの集団で既に報告されているβグロビン遺伝子全体の3.4kb欠失の検出を行った21。
結果
ホモ接合体または複合ヘテロ接合体のβサラセミア患者8人、βサラセミア/HbE患者57人、ヘテロ接合体βサラセミア15人から合計88個のβサラセミアアレルが我々の研究に含まれた。 80人の被験者はすべて血縁関係のない家族の出身で、93.8％（75/80人）がバンコクとタイ中央部の他の地方に住んでいた。 臨床的にβサラセミアが認められたこれら65人のうち、92.3％（60/65人）と7.7％（5/65人）がそれぞれβサラセミア大とTIを呈していた。 60人の主要なβサラセミア患者では、86.7％（52/60）がβサラセミア/HbEであったのに対し、ホモ接合体または複合ヘテロ接合体のβサラセミアは13.3％（8/60）だけであった。 また、ホモ接合体または複合ヘテロ接合体のβサラセミア患者全員とβサラセミア/HbE患者の91.2％（52/57）が重症の輸血依存性βサラセミアを呈していることがわかった。 遺伝子型については、コドン41/42（-TCTT）/コドン26（G>A）またはβEが40％と最も多く、次に多かったのはコドン17（A>T）/βEで18％であった。218>
  |
表1 臨床症状のあるβサラセミア患者65名の遺伝子型 |
 |
Figure 1 Beta-thalsemia患者の遺伝子型の種類 |
これら88のβサラセミア対立遺伝子の分子基盤を解明するために、まず2セットのM-ARMSによって各患者のDNAを特徴づけた。 この方法で75の対立遺伝子（85.2％）が同定され，その中にはコドン41/42（-TCTT）の33対立遺伝子（37.5％），23対立遺伝子（26.1%）、IVS-I-5 (G>C) の7つのアレル（8%）、IVS-II-654 (C>T) の6つのアレル（6.8%）、IVS-I-1 (G>T) の4つのアレルス（4.5%）、コドン71/72 (+A) の2つのアレル (2.3%) であった（表2）。 興味深いことに、ヌクレオチド-28（A>G）は我々の調査では確認されなかった。 13のアレル（14.8%）では、どちらのセットもβサラセミア変異を認めなかった。 そこで、βグロビン遺伝子の3つのコーディングエクソンとその近傍のエクソン-イントロン接合部のDNA配列を直接決定することが、これら13のアレルの特徴を明らかにする次のステップであった。 その結果、コドン35 (C>A) の4つのアレル (4.5%) と開始コドン変異 (ATG>AGG), コドン15 (G>A), コドン19 (A>G), コドン27/28 (+C) とコドン123/124/125 (-ACCCCACC) の1アレル (1.1%), 合計9アレル (10.2%) でそれぞれ6種類の珍しい変異を検出した (Figure 2)。 M-ARMSとDNAシークエンスで未解決の残りのアレルをさらにgap-PCRで3.4kb欠失を検出し、この欠失は残りの4つのアレルのすべてで認められた（4.5%）
 |
表2 88アレルにおけるβサラセミア変異頻度 |
 |
Figure 2 直接DNA配列決定で判明した6種類の珍しい変異 |
全体として、我々の88のβサラセミアアレルが、2セットのM-ARMS、直接DNA配列決定、3.4kb欠失検出ギャップPCRなどのこれらの技術の組み合わせによって100％特徴づけされた。 βE-グロビン遺伝子を除くと、本研究では13種類のβサラセミア変異が遭遇した。 コドン41/42の4bp欠失（-TCTT）は本研究で同定された最も一般的な変異であり、アレルの37.5％を占めた。 コドン17（A>T）は2番目に多く、対立遺伝子の26.1％を占めた。 この2つの変異を合わせると、罹患した対立遺伝子の半分以上（63.6％）を占めた。
考察 この研究は、患者の90％以上がバンコクとこの地域の他の地方に住んでいたため、特にタイ中央部の小児患者におけるβサラセミア変異の頻度分布に関する有益な情報を提供するものであった。 臨床的にβサラセミアを発症した小児の92％がβサラセミアmajorの表現型を持ち、βサラセミアmajorの小児患者の85％以上がタイで高い頻度でみられるβサラセミアとHbEの複合ヘテロ接合体を有していた5,6,8,10。 HbEはHb電気泳動で容易に検出できるため、βE-グロビン遺伝子の頻度はβサラセミア変異頻度の解析に含めなかった
いくつかの方法でβサラセミア変異を判定することができる14。-17 この研究では、M-ARMSは中国と東南アジアの集団でよく見られる7つの変異を検出し、以前の報告と同様に85.2％の対立遺伝子を検出することができた。19,20 M-ARMSは採用したプライマーに固有の所定の変異セットしか検出できないため、直接DNA配列決定が次のステップでβグロビン遺伝子におけるさまざまな点変異と小さな再配列を特定するために行われる。 6つの頻度の低い突然変異が対立遺伝子の10.2%に同定された。 DNA配列決定の欠点は、遺伝子の大きな欠失が検出されないことである。 このため、gap-PCRは、タイの集団で以前報告された3.4kbの欠失を検出するための最終ステップである21。これらの手法を組み合わせることで、我々の研究の小児患者の88のアレルすべて（100%）でβサラセミア変異を特定することができた。 最も多く検出された2つの変異はコドン41/42（-TCTT）とコドン17（A>T）であり，それぞれ罹患アレルの37.5％と26.1％を占めた。 M-ARMSで検出されたその他の一般的な変異はすべて、対立遺伝子の21.6%を占めた。 タイにおけるβサラセミア変異の先行研究と比較すると、これにより、本研究で同定されたβグロビン遺伝子変異の頻度が異なることが明らかになった。 まず、ヌクレオチド-28 (A>G) は我々の研究では確認されなかった。 28 (A>G)はβ+サラセミア変異で、軽度のβ-サラセミア表現型を引き起こすため、この変異はTI患者にのみ観察される。 このことは、この突然変異が我々の研究で観察されなかった理由を説明しているかもしれない。 次に，コドン41/42 (-TCTT), コドン17 (A>T), IVS-II-654 (C>T), コドン71/72 (+A), IVS-I-1 (G>T), IVS-I-5 (G>C) など他の共通変異の頻度はタイ中部での他の研究同様だった8，10 しかし本検討のアリル頻度はタイの他の地域の研究とは違っていた． コドン41/42（-TCTT）は、主にタイ中央部に住む我々の集団で確認された最も一般的な変異であった。 このフレームシフト変異は、タイの他の地域、中華人民共和国、東南アジアでも最もよく見られる変異である20。コドン17（A>T）がタイ中部、北部、東北部で2番目によく見られる変異アリルである一方、IVS-I-5（G>C）はタイ南部で2番目によく見られる変異であると以前に報告されている23。 また、コドン71/72（+A）は、タイ北部で6％、タイ東北部で13.1％であるのに対し、本研究では2.3％であり、この地域でこの変異の頻度が高いことが示唆された。
コドン35 (C>A), コドン15 (G>A), コドン19 (A>G) またはHb Malay, コドン27/28 (+C), 開始コドン変異 (ATG>AGG) とコドン123/124/125 (-ACCCCACC) など6種類の珍しい変異を直接DNA配列決定により確認できた． 新たな変異は検出されなかったが、タイでは珍しい2つの変異、開始コドン変異とエクソン3の8bp欠失が見つかった。 開始コドン変異（ATG>AGG）は1990年に中国のβサラセミア患者で初めて報告された25。タイでは2005年にβサラセミア／HbEの2人の兄弟でこの変異が一度報告されている26。 この変異はβグロビン鎖合成に重大な影響を与え、β0サラセミアという表現型を引き起こす可能性が高いが、報告された3人の患者はいずれも表現型が軽度であり、中国人患者ではヘテロ接合性3.7kb欠失α-thal-2遺伝子型との共連れ性、タイの2人の兄弟では-158（G）ガンマグロビン遺伝子におけるC>T多型と関連していると説明することができる。 この患者の表現型は輸血依存性βサラセミアで、生後9カ月で診断された。遺伝子型はコドン41/42（-TCTT）と開始コドン変異の複合ヘテロ接合体であった。 両変異対立遺伝子はβ0-サラセミア表現型を引き起こす。 エキソン3またはコドン123/124/125における8塩基の欠失（-ACCCCACC）は、重度のβサラセミア/HbE表現型を持つタイ北東部の子供で初めて特徴付けられた27。この欠失により、135のアミノ酸βX鎖（βKhon Kaen）が合成されるが、これは非常に不安定で翻訳後すぐに分解される。
β-サラセミア/HbEはタイにおける主要なサラセミア問題であり、軽度の中間型サラセミアから重度の輸血依存性大サラセミアまで様々な臨床表現型を伴うことがある5，6，8，10． 我々の研究のように、主要なベータサラセミア患者の85％、TI患者の100％が複合ヘテロ接合のベータサラセミアとHbEを有していた。 大βサラセミアでは、最もよく遭遇する遺伝子型はコドン41/42（-TCTT）/βE（40％）、次いでコドン17（A>T）/βE（18.3%）、IVS-I-5（G>C）/βE（8.3%）、IVS-II-654（C>T）/βE（8.3%）であり、検出した遺伝子型全体の75%を占めるに至っている。 28
興味深いことに、コドン19 (A>G)/βEを持つ我々の患者は、軽度のTIではなく、輸血依存性の大サラセミア症状を呈した。 一方，コドン41/42（-TCTT），コドン17（A>T），3.4kb欠失，IVSI-1（G>T），βEという4つのβ0変異の複合ヘテロ接合体は，βサラセミア大形表現型の代わりにTIを呈した． この現象はいくつかの遺伝的および非遺伝的要因によって説明することができ、それらは本疾患の多様性を決定する役割を果たすと考えられる。5,22,29,30 しかし、本研究では追加の遺伝子解析（遺伝子修飾因子）は行わなかった。 この技術は迅速で、大サラセミアのような選択的流産を減らす目的で遺伝的障害を特定するための非侵襲的臨床ツールとして適している。
結論として、本研究は、タイの子供におけるβサラセミアを引き起こす分子欠損の異質性を実証している。 すべてのβサラセミアアレルが、M-ARMS、直接DNA配列決定、3.4kb欠失検出のためのgap-PCRなどの技術を組み合わせて特徴づけられている。 我々の研究では13の突然変異がβサラセミア遺伝子の100％を占めた。 得られた頻度は、主にタイ中央部に住む小児患者のβグロビン遺伝子変異の頻度を表していると考えられる。
謝辞
本研究はPhramongkutklao College of Medicineの承認と資金提供を受けた。
Disclosure
著者らはこの研究において利益相反はないと宣言している。
|
Weatherall DJ. サラセミア症候群． Tex Rep Biol Med. 1980;40:323-333. |
|
|
Vichinsky EP.S。 世界的なサラセミアのパターンの変化。 2005;1054:18-24. |
|
|
Fucharoen S, Winichagoon P. Haemoglobinopathies in southeast Asia.（東南アジアにおけるヘモグロビン血症）。 Indian J Med Res. 2011;134:498-506. |
|
|
Fucharoen S, Ketvichit P, Pootrakul P, Siritanaratkul N, Piankijagum A, Wasi P. Clinical manifestation of beta-thalassemia/hemoglobin E disease. J Pediatr Hematol Oncol. 2000;22(6):552-557. |
|
|
Akhavan-Niaki H, Derakhshandeh-Peykar P, Banihashemi A, et al. A comprehensive molecular characterization of beta thalassemia in a highly heterogeneous population. Blood Cells Mol Dis. 2011;47(1):29-32. |
|
|
Fucharoen S, Winichagoon P. Hemoglobinopathies in Southeast Asia: molecular biology and clinical medicine.東南アジアのヘモグロビン症：分子生物学と臨床医学.日本学術振興会特別研究員. Hemoglobin. 1997;21(4): 299-319. |
|
|
Giardine B, van Baal S, Kaimakis P, et al. HbVar database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations(ヒトヘモグロビン変異体とサラセミア変異体のデータベース)。 2007年更新。 Hum Mutat. 2007;28(2):206. |
|
|
Wasi P, Pootrakul S, Pootrakul P, Pravatmuang P, Winichagoon P, Fucharoen S. Thalassemia in Thailand.タイ王国におけるサラセミア症について。 Ann N Y Acad Sci. 1980;344: 352-363. |
|
|
Fukumaki Y, Fucharoen S, Fucharoen G, et al. Molecular heterogeneity of beta-thalassemia in Thailand.タイにおけるサラセミアの分子的不均一性. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1992;23 Suppl 2:14-21. |
|
|
Thein SL, Winichagoon P, Hesketh C, et al. The molecular basis of beta-thalassemia in Thailand: application to preatal diagnosis.タイにおけるベータサラセミアの分子的基盤：出生前診断への応用。 Am J Hum Genet. 1990;47(3):369-375. |
|
|
Fucharoen S, Fucharoen G, Sriroongrueng W, et al. Molecular basis of beta-thalassemia in Thailand: Analysis of beta-thalassemia mutations using the polymerase chain reaction.All Rights Reserved.タイにおけるβサラセミアの分子基盤:出生前診断への応用(1992). Hum Genet. 1989;84(1):41-46. |
|
|
Mirasena S, Shimbhu D, Sanguansermsri M, Sanguansermsri T. Detection of beta-thalassemia mutations using a multiplex amplification refractory mutation system assay.タイにおけるβサラセミア変異の検出（第Ⅱ報）。 Hemoglobin. 2008;32(4):403-409. |
|
|
Bhardwaj U, Zhang YH, Lorey F, McCabe LL, McCabe ER.を参照。 アフリカ系アメリカ人、アジア系インド人、東南アジア人、中国人に多いβサラセミア変異について、新生児スクリーニング試料から分子遺伝学的確認試験を行った。 Am J Hematol. 2005;78(4):249-255. |
|
|
Sirichotiyakul S, Saetung R, Sanguansermsri T. Analysis of beta-thalassemia mutations in northern Thailand using an automated fluorescence DNA sequencing technique.All Rights Reserved.「タイ北部におけるベータサラセミア変異の解析。 Hemoglobin. 2003;27(2): 89-95. |
|
|
Fucharoen S, Fucharoen G, Ratanasiri T, Jetsrisuparb A, Fukumaki Y.A.・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18.6.2.2. βサラセミア/HBE病の簡易非放射性検出法：出生前診断への応用。 Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1995;26 Suppl 1:278-281. |
|
|
Ho PJ, Hall GW, Luo LY, Weatherall DJ, Thein SL.を参照のこと。 中型ベータサラセミア：遺伝子型から表現型を一貫して予測することは可能か？ Br J Haematol. 1998;100(1):70-78. |
|
|
Old JM, Khan SN, Verma I, et al. A multi-center study in order to further define the molecular basis of beta-thalassemia in Thailand, Pakistan, Sri Lanka, Mauritius, Syria and India, and amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction による簡単な分子診断ストラテジの開発.A computer and systems in Japan. Hemoglobin. 2001;25(4):397-407. |
|
|
Kazazian HH Jr, Dowling CE, Waber PG, Huang S, Lo WH.H., Kazazian HH Jr, Dowling CE, Waber PG, Huang S, Lo WH. 中国と東南アジアにおけるβサラセミア遺伝子のスペクトラム。 Blood. 1986;68(4):964-966. |
|
|
Sanguansermsri T, Pape M, Laig M, Hundrieser J, Flatz G. Thai familyにおけるβゼロサラセミアはβグロービン遺伝子全体を含む 3.4 kb欠失によって引き起こされる.Butz. Hemoglobin. 1990;14(2):157-168. |
|
|
Nuntakarn L, Fucharoen S, Fucharoen G, Sanchaisuriya K, Jetsrisuparb A, Wiangnon S. Molecular, hematological and clinical aspects of thalassemia major and thalassemia intermedia associated with Hb E-beta thalassemia in Northeast Thailand.タイ北部の家族性サラセミアの分子的・血液学的・臨床的特徴。 Blood Cells Mol Dis. 2009;42(1):32-35. |
|
|
Nopparatana C, Panich V, Saechan V, et al. The spectrum of beta-thalassemia mutations in southern Thailand.タイ南部におけるβサラセミア変異のスペクトラム(英語)。 Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1995;26 Suppl 1:229-234. |
|
|
Laosombat V, Nopparatana C, Wongchanchailert M, Wiriyasateinkul A. Molecular basis of beta-thalassemia in Thai Muslim patients in the south of Thailand.タイ南部のムスリムの患者のベータサラセミアの分子的基盤。 Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1997; 28 Suppl 3:104-105. |
|
|
Lam VM, Xie SS, Tam JW, Woo YK, Gu YL, Li AM.を参照のこと。 中国人のβサラセミック患者の増幅ゲノムDNAで確認された開始コドンでの新しい1塩基変化（ATG—–AGG）。 Blood. 1990;75(5):1207-1208. |
|
|
Viprakasit V, Chinchang W, Suwanthol L, Tanphaichitr VS.を参照。 アジア人における稀なβ-グロビン開始コドン変異（ATG–>AGG）の共通起源。 Clin Lab Haematol. Dec 2005;27(6):409-415. |
|
|
Fucharoen G, Fuchareon S, Jetsrisuparb A, Fukumaki Y.（邦訳は「アジア人におけるβグロビン開始コドン変異の共通起源」）。 βグロビン遺伝子のエクソン3における8塩基の欠失により、封入体βサラセミア形質を持つ新規変異体（βコンカーン）が生じた。 Blood. 1991;78(2):537-539. |
|
|
Yang KG, Kutlar F, George E, et al. Hb Eβ-サラセミアおよび大サラセミア患者のマレー系におけるβ-グロビン遺伝子突然変異の分子的特徴づけ(Molecular characterization of beta-globin gene mutations in Malay patients with Hb E-beta-thalassaemia and thalassaemia major. Br J Haematol. 1989;72(1):73-80. |
|
|
Olivieri NF, Pakbaz Z, Vichinsky E. HbE/beta-thalassemia: basis of marked clinical diversity.The HbE/salasemia major.（「HbE／β-サラセミア：著しい臨床的多様性」の基礎 HbE/βサラセミア：顕著な臨床的多様性の基礎。 |
|
|
Nasri NW, Jamal AR, Abdullah NC, Razi ZR, Mokhtar NM.を参照。 β-グロビン遺伝子のコドン17と26の単細胞DNA分析を用いたβサラセミアの着床前遺伝子診断。 2009;40(1):1-9. |
|
|
Hung CC, Chen SU, Lin SY, et al. 蛍光共鳴エネルギー移動ハイブリッドプローブとリアルタイムポリメラーゼチェーン反応を用いたβサラセミア症の着床前遺伝学診断.2009.1(1):1-9.Hung CC, Chen SU, Lin SY, etc. All the Preimplantation genetic diagnosis of betathalsemia using real-time polymerase chain reaction with fluorescance resonance energy transfer hybridization probe. Anal Biochem. 2010;400(1):69-77. |