I trifosfati deossinucleotidici (dNTP) sono i mattoni essenziali delle molecole di acido nucleico, e come tali sono componenti necessari delle miscele PCR poiché nessun nuovo DNA (amplificato) potrebbe essere generato senza di loro. I quattro deossinucleotidi individuali che compongono una sequenza di DNA (cioè deossiadenosina trifosfato, dATP; deossitimidina trifosfato, dTTP; deossicitosina trifosfato, dCTP; e trifosfato di deossiguanosina, dGTP) vengono solitamente aggiunti alle miscele PCR e RT-PCR in quantità equimolari, anche se se la sequenza di DNA target da amplificare in PCR comprende principalmente dATP/dTTP (rapporto AT) o principalmente dGTP/dCTP (rapporto GC), allora il rapporto molare dei dNTP aggiunti alla miscela PCR può essere modificato per tenere conto di questo squilibrio. I dNTP sono di solito acquistati singolarmente o come mix (equimolare) da fornitori commerciali (ad esempio Roche, Promega, ecc.), e sono chimicamente stabili se conservati in soluzioni acquose leggermente alcaline a -20°C. Tuttavia, va notato che i dNTP sono naturalmente acidi in soluzione; quindi le soluzioni di lavoro e di stock possono dover essere neutralizzate con composti alcalini prima della conservazione a lungo termine. Le soluzioni neutralizzate di dNTP sono normalmente regolate a soluzioni stock di 10 mM tramite spettrofotometria, o aggiungendo il volume corretto di acqua sterile al prodotto liofilizzato direttamente dopo la sua sintesi chimica. Alcune PCR possono trarre vantaggio dall’uso di dNTP altamente purificati “PCR-grade” (Roche) che contengono meno dello 0,9% di deossinucleotidi difosfati (dNDP), sono >99% puri, e privi di contaminanti come nucleotidi modificati e tetrapyrophosphate. Questi (più costosi) dNTP ad alta purezza possono essere utili per amplificare con successo il DNA PCR da preparazioni contenenti un numero molto basso di copie di DNA bersaglio.
In alcune applicazioni e protocolli PCR, uno dei quattro dNTP può essere sostituito da un analogo, dNTP, ad esempio inosina, 7-deaza-2′ -deoxyguanosina, o un dNTP modificato, ad esempio un dNTP marcato con biotina, fluoroforo o radioattivo. Tali modifiche consentono di eseguire ulteriori applicazioni di elaborazione post-PCR a valle.