Sinergia funzionale positiva di dimeri proteici artificiali strutturalmente integrati assemblati dalla chimica di Click

Siti di interfaccia della chimica di Click

Abbiamo supposto che le aree della superficie di una proteina che sono compatibili in termini di associazione hanno maggiori probabilità di generare una struttura integrata attraverso la formazione di interazioni non covalenti reciprocamente compatibili. Poiché le proteine sono monomeriche, queste interazioni sono, nel migliore dei casi, deboli e transitorie, quindi non persisteranno, abbiamo pensato che avevamo bisogno di un “bullone” molecolare come parte del sito di interfaccia per promuovere e stabilizzare le nuove interazioni. Il primo passo è quello di identificare le regioni sulle proteine bersaglio che hanno il potenziale intrinseco di interagire. ClusPro 2.040 (cluspro.org) è stato utilizzato per generare potenziali configurazioni dimer. I modelli di omodimeri sfGFP prodotti sono stati raffinati, analizzati e classificati utilizzando RosettaDock41,42 (Tabella 1 supplementare). La configurazione più alta classificata è mostrata in Fig. 1b (che è il modello più vicino alla struttura determinata sotto; vide infra), con le prossime 4 configurazioni classificate mostrate in Fig. 1 supplementare. Mentre sono stati osservati diversi orientamenti di una sfGFP rispetto all’altra, il docking ha rivelato che i residui 145-148, 202-207 e 221-224 sono stati trovati abitualmente per contribuire all’interfaccia del dimero. Per imbullonare le due proteine insieme, è stata usata la chimica Click geneticamente codificata (Fig. 1a). Il vantaggio rispetto, per esempio, legami disolfuro includono catene laterali più lunghe per superare potenziali scontri sterici, migliore stabilità di crosslink e la capacità di generare non-simmetrici (diversi residui di collegamento su diversi monomeri) e eterodimeri in un progettato 1-to-1 modo (vide infra).

Basato sui modelli dimer, tre residui sono stati selezionati per la sostituzione con i due ncAAs Click compatibile, SCO43 (alchine tese) e azF (azide)44,45 (Fig. 1a). H148 e Q204 sono stati scelti in base alla loro posizione all’interfaccia putativo dimer (Fig. 1b e Fig. 1 supplementare). Entrambi i residui sono noti per essere prontamente modificato con piccole molecole addotti cicloottilene su incorporazione azF34,46, e si trovano vicino al centro funzionale, il cromoforo sfGFP (CRO) (Fig. 1b). Analisi di spostamento di mobilità del gel ha rivelato che la dimerizzazione è stato successo (Fig. 1c, d), questo è stato confermato da analisi di spettrometria di massa (Fig. supplementare 2). Residuo 132 non è stato previsto per essere all’interfaccia dimero (Fig. 1b e Supplementare 1), ma è noto per essere compatibile con una serie di alchine tese addotti che vanno da coloranti46 a nanotubi di carbonio 35 a DNA a singolo filamento 36. Così, agisce come un buon test della nostra capacità di prevedere interfacce proteina-proteina e compatibilità reazione Click. Nonostante il residuo 132 essendo superficie esposta, nessun prodotto dimero è stato osservato utilizzando sfGFP132azF con SCO contenente proteina (Fig. 3 supplementare) indicando l’importanza della compatibilità interfaccia di superficie e l’utilità di analisi in silico per aiutare a identificare i siti compatibili chimica click. O scontri sterici e/o interazioni proteina-proteina che persistono più a lungo in altre regioni possono ostacolare la reticolazione covalente al residuo 132.

Positivo commutazione funzionale sulla formazione di sfGFP148x2 dimero

H148 forma un legame H con CRO (Fig. 1b) e svolge un ruolo importante nel proton shuttling che regola la popolazione del neutro A (λmax ~ 400 nm, CRO A) e la forma anionica B (λmax ~ 490 nm, CRO B)47 presente nello stato fondamentale. La forma B predomina in sfGFP ma incorporando azF al posto di H148 (sfGFP148azF) la rimozione del legame H risulta nello stato A che ora predomina33,34 (Fig. 2a e Tabella 1). Incorporando SCO al residuo 148 (sfGFP148SCO) si ottiene un effetto simile, con CRO A predominante ma con un minore spostamento verso il rosso (λmax 492 nm) nella forma minore CRO B (Fig. 2a e Tabella 1).

La dimerizzazione di sfGFP148azF e sfGFP148SCO produce due significativi effetti positivi: (i) accende la fluorescenza a ~490 nm a causa della promozione della forma CRO B; (ii) luminosità notevolmente migliorata attraverso un aumento del coefficiente di assorbanza molare a 490 nm (Fig. 2a e Tabella 1). Il picco di eccitazione principale è spostato in rosso sulla dimerizzazione (λmax 492 nm) rispetto a sfGFPWT (λmax 485 nm) (Tabella 3 supplementare). Il rapporto di assorbanza di 490:400 nm si sposta di un ordine di grandezza da ~0,5 per i monomeri a ~5 per il dimero, con la forma CRO B che domina lo spettro di assorbanza del dimero (Fig. 2a) nonostante l’apparente assenza di una specie che può sostituire il ruolo del gruppo imidazolo H148. Esempi precedenti di modifica sfGFP148azF con addotti di piccole molecole o fotoattivazione al meglio risultano in parziale conversione in forma CRO B33,34. L’interruttore di 10 volte in assorbanza è rispecchiato in emissione di fluorescenza; eccitazione a 490 nm risultati ~ 20 volte maggiore emissione di entrambi i monomeri (Fig. 2a). Inoltre, il dimero mostra una funzione migliorata anche rispetto al superfiltrato originale sfGFPWT (Fig. 2b e Tabella 1). L’assorbanza molare e la luminosità sono aumentate di ~320% per sfGFP148x2 (~160% su una base per CRO) (Fig. 2b) superiore a quanto previsto per un semplice aumento additivo se le unità monomeriche agiscono indipendentemente l’una dall’altra.

Per indagare l’importanza del legame bioriginale abbiamo costruito un classico legame basato sul disolfuro mutando H148 in cisteina. Le varianti sfGFPH148C si sono dimerizzate ma solo in presenza di Cu2+ (Fig. 4 supplementare). Le proprietà spettrali hanno suggerito che il dimero era meno fluorescente rispetto a sfGFP148x2 e sfGFPWT (Fig. 4 supplementare). Il monomero sfGFPH148C ha mostrato l’atteso passaggio da CRO B a CRO A. Mentre un passaggio da CRO A a CRO B è stato osservato sulla dimerizzazione di sfGFPH148C, il dimero aveva una assorbanza inferiore per CRO molare rispetto a sfGFPWT e significativamente inferiore a sfGFP148x2; una popolazione significativa dello stato A è stata ancora osservata. L’emissione di fluorescenza sull’eccitazione a 490 nm per il dimero sfGFPH148C era circa la metà di quella di sfGFPWT. Quindi, l’approccio biortogonale ha generato una specie dimerica più performante del classico legame disolfuro.

Base molecolare per la commutazione funzionale in sfGFP148x2

La struttura cristallina di sfGFP148x2 (vedi Tabella 2 supplementare per le statistiche) rivela che i monomeri formano un’estesa interfaccia dimera con interazioni a lungo raggio che collegano i due centri CRO. Le unità monomeriche di sfGFP148x2 si dispongono in una disposizione quasi simmetrica testa-coda sfalsata di ~45° l’una rispetto all’altra (Fig. 3a). La disposizione antiparallela dei monomeri fianco a fianco è la più vicina a quella del modello più alto in classifica (Fig. 1 supplementare e Tabella 1 supplementare). La densità elettronica del nuovo crosslink triazolico è chiaramente definita (Fig. 3b) e forma il link allungato anti-1,4-triazolo che è parzialmente sepolto e intimamente associato con entrambe le unità monomeriche in modo da formare una parte integrante dell’interfaccia del dimero (Fig. 3c). I CRO sono distanti 15 Å e puntano l’uno verso l’altro (Fig. 3a).

L’interfaccia ha caratteristiche simili ai dimeri naturali48. Area sepolta interfaccia è ~1300 Å2, con generalmente gli stessi residui da ogni monomero contribuendo (Fig. 3c, d). H-bonding gioca un ruolo importante con residui E142, N146, S147, N149 e N170 da entrambi i monomeri che contribuiscono a otto inter-subunità H-bond (Fig. 3b). La struttura mostra che le interfacce dimeriche naturali possono essere imitate e stabilizzate attraverso l’uso di monomeri collegati con Click, che la modellazione originale suggeriva che fossero fattibili, ma dove probabilmente erano troppo deboli o transitori per persistere senza il legame incorporato. Quindi, è possibile che il nostro approccio possa essere usato per stabilizzare interazioni proteina-proteina deboli e transitorie in modo da formare interfacce definite.

La dimerizzazione induce una serie di cambiamenti conformazionali per formare una rete di interazioni a lungo raggio che è alla base del meccanismo con cui sfGFP si accende e migliora la luminosità. La struttura di sfGFP148azF (PDB 5BT0)34 mostra che 148azF occupa una posizione simile a H148 in sfGFPWT ma non può dal legame H critico al gruppo OH del fenolo CRO che promuove la formazione dello stato CRO B. Nella dimerizzazione, la modifica di 148azF attraverso la formazione del legame triazolico con 148SCO nel monomero cognato provoca un cambiamento sia nella posizione della sua spina dorsale che della catena laterale causando un buco che ora può essere occupato da una molecola d’acqua nel dimero (W1azF in Fig. 4a). L’acqua può legarsi a CROazF e al carbonile della spina dorsale di 148azF (Fig. 4). Un’acqua equivalente è presente nell’unità monomerica sfGFP148SCO, (W1SCO) che forma interazioni simili. Queste molecole d’acqua strutturate hanno il potenziale per sostituire l’interazione H-bond persa con la rimozione di H148, attivando così il dimero attraverso la promozione della formazione di CRO B nello stato di terra. Le molecole d’acqua sono anche sepolte all’interfaccia del dimero quindi lo scambio dinamico con il solvente bulk sarà molto ridotto. Inoltre, le due CRO sono ora collegati da una rete estesa prevalentemente acqua che si estende l’interfaccia dimer (Fig. 4b, c). L’analisi della composizione del tunnel ha rivelato che tre molecole d’acqua in ogni unità (W1azF/SCO, W2azF/SCO e W3azF/SCO) sono simmetriche; W4 combinato con la spina dorsale di F145SCO fornire il ponte attraverso l’interfaccia dimer per collegare le due reti di acqua insieme. Così, la dimerizzazione genera un’estesa rete di legami H ricca di acqua tra i monomeri, promuovendo così il passaggio dallo stato A CRO alla forma B.

L’analisi della fluorescenza di una singola molecola di sfGFP148x2

La microscopia di fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è stata usata per studiare il comportamento fluorescente dei dimeri sfGFP148x2 a livello di singola molecola. L’andamento temporale dell’intensità di fluorescenza dei singoli dimeri sfGFP148x2 ha dimostrato una gamma di stati di intensità, con una fluorescenza a ~80-100 conteggi predominante e una maggiore longevità rispetto alla sottopopolazione di stati di intensità più alta, caratterizzata da brevi incursioni in una gamma di intensità da ~100 a 300 conteggi (Fig. 2c). Le tracce di fluorescenza dimostrano anche una prolungata fotostabilità con lunghi periodi di photobleaching (Fig. 2c e Fig. 5 supplementare). In confronto, sfGFPWT photobleaches più rapidamente, con tracce di fluorescenza che mostrano un unico stato di intensità in cui gli stati on generalmente durano per periodi più brevi (Fig. 6 supplementare). Inoltre, sfGFPWT monomerico è stato talvolta trovato in uno stato iniziale scuro, non fluorescente, prima dell’inizio della fluorescenza e del successivo photobleaching (Fig. 6 supplementare). L’estrazione della media della fluorescenza consecutiva ‘on time’ prima del photobleaching e dell’occupazione di stati transitori non fluorescenti (blinking) trova che sfGFP148x2 mostra periodi più lunghi di fluorescenza continua (media 0,9 s), rispetto a sfGFPWT (0,65 s). Data la somiglianza nell’intensità di fluorescenza misurata della singola molecola, l’aumento dei tempi di accensione e la durata del photobleaching probabilmente contribuiscono all’aumento della fluorescenza osservata nelle misure di ensemble allo stato stazionario di sfGFP148x2 (Fig. 2a).

Nel tentativo di razionalizzare la gamma di stati di fluorescenza osservati nelle tracce dei dimeri, è stato generato un istogramma di tutte le intensità misurate (Fig. 2c). A differenza di sfGFPWT (Fig. 6 supplementare) che mostra una singola distribuzione log-normale49, sfGFP148x2 ha favorito un adattamento a due componenti50 (Fig. 2c). La distribuzione dell’intensità misurata mostra un picco predominante di intensità inferiore (~ 90 conteggi) e un picco parzialmente sovrapposto di intensità superiore, come conseguenza delle brevi incursioni a stati di intensità superiore osservati nelle tracce di fluorescenza singola molecola. Mentre una distribuzione bimodale intensità potrebbe ordinariamente essere previsto in un dimero composto da due co-locate indipendentemente fluorofori attivi, con ogni fluoroforo sequenzialmente photobleaching, le tracce di intensità singola molecola tempo-corso non sono coerenti con questo modello e mostrano una mancanza due stati ben definiti. Il semplice comportamento di stato on/off di sfGFPWT è raramente osservato nelle tracce dimeriche che non si presentano come l’addotto previsto di due tracce monomeriche, mostrando invece un comportamento più complesso.

Funzione migliorata sulla formazione del dimero sfGFP204x2

Per esplorare come diversi siti di collegamento possono suscitare effetti funzionali, abbiamo studiato il dimero alternativo sfGFP204x2 (Fig. 5a) costruito sopra (Fig. 1d). Abbiamo trovato che la dimerizzazione ha migliorato le proprietà spettrali rispetto alla semplice aggiunta delle proteine monomeriche o sfGFPWT, evidenziando ancora una volta i benefici sinergici della dimerizzazione. L’incorporazione di azF o SCO al residuo 204 ha avuto poco effetto sulle proprietà spettrali rispetto a sfGFPWT 46 (Fig. 5b e Tabella 1). La forma B CRO ha predominato nelle forme monomeriche; sia l’assorbanza molare che le intensità di emissione erano simili tra loro e con sfGFPWT. L’emissione di fluorescenza di sfGFP204SCO era leggermente ridotta (80% di sfGFPWT; Tabella 1). Formando il dimero sfGFP204x2 (vedi Fig. 1d e Fig. 2 per le prove) l’analisi spettrale ha mostrato un miglioramento funzionale in termini di parametri spettrali fondamentali: coefficiente di assorbanza molare (ε) ed emissione di fluorescenza (Fig. 5b e Tabella 1). Sulla dimerizzazione, ε è aumentato fino al 400% rispetto ai monomeri di partenza a 160.000 M-1 cm-1. Questo equivale a una assorbanza media per CRO molare di 80.000 M-1 cm-1, quasi raddoppiando la luminosità rispetto ai monomeri di partenza, e 31.000 M-1 cm-1 superiore rispetto a sfGFPWT. In linea con l’aumentata capacità di assorbire la luce, anche l’emissione di fluorescenza è stata migliorata; l’emissione normalizzata per CRO era del 180% più alta rispetto al monomero sfGFP204azF. Usando il calcolo di Strickler-Berg51 (sito web huygens.science.uva.nl/Strickler_Berg/) i tempi di vita della fluorescenza scendono da 3,2 ns per sfGFPWT a 0,92 ns per sfGFP204x2. Quindi, come per sfGFP148x2 la struttura dimerica di sfGFP204x2 ha una maggiore probabilità di eccitazione elettronica e di emissione di fluorescenza rispetto alle forme monomeriche (vedi Fig. 8 supplementare per il confronto spettrale dei dimeri). Questo è tanto più impressionante per entrambe le forme dimeriche in quanto sfGFPWT è un punto di riferimento per le prestazioni della proteina fluorescente verde.

L’importanza della simmetria per la sinergia

Gli omodimeri proteici naturali sono generalmente simmetrici1,52 e tale simmetria è stata imitata nel nostro dimero artificiale attraverso un residuo comune di crosslink. Abbiamo studiato l’importanza di un residuo di crosslink comune (come un mimico di simmetria strutturale) per la sinergia funzionale. Il vantaggio della chimica biorigonale è che le maniglie di reazione reciprocamente compatibili permettono la costruzione di coppie definite (cioè, 148 + 204 = 148-204 e non 148-148 o 204-204) in modo da impedire la formazione di prodotti indesiderati che saranno difficili da separare.

Sono stati generati dimeri che hanno collegato i residui 148 e 204 nelle due combinazioni disponibili (148SCO+204azF e 148azF+204SOC). La fluorescenza allo stato stazionario ha rivelato che in entrambe le forme dimeriche, le forme protonate e deprotonate di CRO erano chiaramente presenti (Fig. 6a, b). Il dimero 148azF-204SCO collegato ha esibito un cambiamento nelle popolazioni relative delle forme A e B, con un aumento significativo del coefficiente di assorbanza molare a 490 nm (Fig. 6a); era quasi il doppio dell’originale sfGFP204SCO e ~30% superiore a quello previsto dalla semplice aggiunta degli spettri dei monomeri. L’altezza relativa del picco a 400 nm rimane simile sia in sfGFP148azF che nel dimero 148azF-204SCO collegato, suggerendo che la popolazione della forma deprotonata è simile nel dimero come nel monomero originale. La dimerizzazione attraverso la combinazione 148SCO-204azF ha cambiato le popolazioni relative delle forme protonate e deprotonate, ma la riduzione del picco di assorbanza a 400 nm non è stata accompagnata da un aumento concomitante del picco a 490 nm (Fig. 6b). Infatti, la dimerizzazione è stata ampiamente dannosa in quanto entrambi i picchi di assorbanza principali avevano un coefficiente di assorbanza molare inferiore rispetto agli spettri di semplice aggiunta dei monomeri (Fig. 6b). È chiaro che i dimeri collegati asimmetricamente sono meno fluorescenti e contengono una significativa popolazione mista dei due stati CRO rispetto ai dimeri collegati simmetricamente, quindi in questo caso la simmetria ha importanti implicazioni funzionali.

Eterodimeri e integrazione funzionale

Gli eterodimeri, in cui un dimero è composto da due proteine diverse, è uno stato di dimerizzazione alternativo comunemente osservato1,2. Ci permette anche di progettare nuovi complessi in cui possono essere collegate proteine funzionalmente distinte. Il vantaggio di accoppiamento bioortogonale è la capacità di generare definito, singola specie (etero)dimeri composto da due unità di proteine diverse (cioè, A + B = A-B non A-A, B-B, A-B miscela che può essere difficile da separare). La proteina fluorescente gialla Venus29 è stata scelta come proteina partner di sfGFP, data la sovrapposizione spettrale tra le due (Fig. 9 supplementare). Le differenze di sequenza sono mostrate nella Fig. 10.

SfGFP148SCO è stata combinata con l’equivalente azF contenente Venus (Venus148azF) per generare GFVen148 (vedi Fig. 11 per le prove). Nuove caratteristiche spettrali emergono suggerendo un sistema integrato è stato generato. La formazione di GFVen148 genera un dimero che mostra una migliore luminosità rispetto a sfGFP148SCO o Venus148azF (Fig. 7a e Tabella 3 supplementare). È interessante notare che il dimero ha proprietà spettrali intermedie dei singoli monomeri senza alcun allargamento significativo del picco (Fig. 7a, b e Fig. 12a supplementare) suggerendo che i due centri CRO sono diventati funzionalmente integrati in termini di emissione di fluorescenza. Il maggiore λmax è 505 nm, intermedio tra sfGFP (492 nm) e Venus (517 nm). L’ε equivalente alla forma B CRO (regione 490-510 nm) aumenta in modo significativo (~4-5 volte), superiore agli spettri additivi semplici dei monomeri, mentre la popolazione A CRO diminuisce ma è ancora osservata (Fig. 7a). Questo è abbinato da un ~ 4 volte aumento dell’intensità di emissione su eccitazione a 505 nm (Fig. 7b). Un singolo picco di emissione si osserva che è anche intermedio tra i due monomeri, indipendentemente dalla lunghezza d’onda di eccitazione (λEM a 517 nm; Fig. 7b, c); un singolo piuttosto che un picco doppio o allargata è stata osservata su eccitazione a 490 nm (in grado di eccitare entrambi CRO) suggerendo che una singola specie sta emettendo. Uno spettro additivo degli spettri dei singoli monomeri che simula due proteine che agiscono indipendentemente supporta l’idea di una nuova funzione integrata in quanto è più ampia e spostata verso il rosso rispetto al profilo di emissione misurato GFVen148x2 (Fig. 12b supplementare). Emissione su eccitazione a 400 nm è stato anche misurato come Venus148azF ha poca assorbanza a questa lunghezza d’onda rispetto al GFVen148. L’intensità di emissione era 30 volte superiore per GFVen148 rispetto al Venus148azF monomerico con picco di emissione a 517 nm (Fig. 7c e Supplementary Fig. 12c). Piuttosto che visualizzare FRET classico, come ci si potrebbe aspettare (vide supra), GFVen148 sembra agire come una singola entità in termini di uscita fluorescenza. Questo potrebbe suggerire che due CRO agiscono ora prevalentemente come una sola specie con gli aspetti strutturali osservati per sfGFP148x2 (come la rete d’acqua) giocando un ruolo. La presenza di un significativo stato A neutro del CRO suggerisce che le due unità monomeriche non sono completamente sincronizzate. Questo non nega comunque il chiaro impatto che la dimerizzazione può avere nella generazione di nuove proprietà spettrali come quelle viste in GFVen148.

Come per sfGFP, l’incorporazione di azF al posto di Q204 (chiamato Venus204azF) ha avuto poco effetto sulle proprietà spettrali di Venus (Tabella 3 supplementare). Il collegamento covalente tramite 204 SPAAC (rendendo GFVen204) ha generato con successo un dimero (Fig. 11 supplementare). GFVen204 combinato le caratteristiche spettrali di entrambi i monomeri generando una specie con λMax sia a 490 e 514 nm (rapporto di 1:1.2) (Fig. 7e, f e Tabella supplementare 3). Venus204 assorbe anche a 490 nm ma in un rapporto di 1:2,7 a 514 nm. La formazione di dimeri ha di nuovo aumentato l’assorbanza molare al di sopra di quella dei singoli monomeri; in particolare ε è aumentata di ~26.000 M-1 cm-1 (~27%) per il Venus associato λmax (514 nm) dove c’è poco contributo per sfGFP. Per studiare la comunicazione tra i monomeri, è stata monitorata l’emissione di fluorescenza sull’eccitazione a quattro lunghezze d’onda separate: 400 nm (solo sfGFP); 450 nm (sfGFP, Venus minore); 490 nm (sfGFP λmax, Venus spalla); 510 (Venus, sfGFP minore). A tutte le lunghezze d’onda di eccitazione, l’unico picco di emissione chiaro era a 528 nm (Fig. 7b), corrispondente a Venere che indica la comunicazione tramite trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET). Un picco di emissione correlato a sfGFP204SCO (~510 nm) non è stato osservato nemmeno sull’eccitazione alle lunghezze d’onda inferiori specifiche per sfGFP. Né è stato osservato il picco di emissione intermedio caratteristico di GFVen148, evidenziando le nuove caratteristiche dell’eterodimero 148. La differenza più significativa è stata osservata su eccitazione a 400 nm dove c’è un aumento di 14 volte dell’intensità di emissione a 528 nm per il GFVen204 rispetto al Venus204azF (Fig. 7f, inserto). L’efficienza relativa FRET calcolata dopo la decomposizione spettrale era circa il 90%. Così, i due centri funzionali stanno comunicando attraverso il trasferimento di energia (Fig. 7g) in modo altamente efficiente.