shRNA – Applicazioni – Cos’è shRNA, come funziona e le sue applicazioni.

Cos’è l’shRNA e come si usa?

Le sequenze di shRNA (short hairpin RNA) sono solitamente codificate in un vettore di DNA che può essere introdotto nelle cellule tramite trasfezione plasmidica o trasduzione virale. Le molecole di shRNA possono essere divise in due categorie principali in base al loro design: shRNA semplici ad anello staminale e shRNA adattati al microRNA. Un semplice shRNA stem-loop è spesso trascritto sotto il controllo di un promotore della RNA polimerasi III (Pol III). La trascrizione di 50-70 nucleotidi forma una struttura stem-loop che consiste in una regione da 19 a 29 bp di RNA a doppio filamento (il gambo) collegata da una regione di RNA prevalentemente a singolo filamento (il loop) e un dinucleotide 3′ overhang. Il semplice gambo-loop shRNA viene trascritto nel nucleo ed entra nel percorso RNAi simile ad un pre-microRNA. Il più lungo (> 250 nucleotidi) shRNA adattato al microRNA è un disegno che assomiglia più da vicino alle molecole native di pri-microRNA, e consiste in una struttura di gambo shRNA che può includere mismatch simili al microRNA, collegati da un loop e affiancati da 5′ e 3′ sequenze di microRNA endogene. Il microRNA-adattato shRNA, come la semplice forcina stem-loop, è anche trascritto nel nucleo, ma si pensa che entri prima nel percorso RNAi simile a un pri-microRNA endogeno.

le tecnologie shRNA sono basate sul DNA, che fornisce flessibilità nella progettazione del vettore. La maggior parte dei sistemi shRNA basati su vettori contengono un marcatore selezionabile per consentire l’eliminazione delle cellule che non sono state trasfettate o trasdotte con successo, e il mantenimento delle cellule con un knockdown genico sostenuto. Le cassette di espressione shRNA possono anche essere incorporate in sistemi vettoriali virali, compresi retrovirus, virus adeno-associati, adenovirus e lentivirus, che permettono un’integrazione stabile ed espressione nel genoma dell’ospite. Queste strategie virali permettono la consegna di shRNA a linee cellulari che sono refrattarie alla trasfezione. Marcatori fluorescenti (come una proteina fluorescente verde o rossa) possono anche essere inclusi per tracciare le cellule che esprimono shRNA. La performance degli shRNA è influenzata da molti fattori, tra cui l’efficienza della trasduzione o della trasfezione, il promotore che guida l’espressione degli shRNA e le modifiche epigenetiche (che possono portare al silenziamento dell’espressione degli shRNA). Inoltre, l’influenza che ognuno di questi fattori ha sulle prestazioni del vettore può differire a seconda della linea cellulare o del tipo di cellula. Le opzioni del promotore e del reporter SMARTchoice sono disponibili per aiutare i ricercatori a selezionare i promotori ottimali per l’espressione di shRNA e il silenziamento genico. Infine, quando queste cassette di espressione shRNA sono accoppiate con promotori inducibili, come con SMARTvector Inducible Lentiviral shRNA o il sistema vettoriale TRIPZ, i ricercatori possono progettare studi per modulare temporalmente e spazialmente l’espressione genica.

Video animazione: RNA interference

Come viene consegnato lo shRNA a una cellula?

Ci sono due opzioni per la consegna dello shRNA basato sul DNA alle cellule. Per i plasmidi, possono essere impiegati i tipici metodi di trasfezione come l’uso di reagenti di trasfezione lipidici o l’elettroporazione. Le particelle lentivirali sono una scelta eccellente per le cellule difficili da trasfettare, e in situazioni in cui è necessaria un’alta efficienza o più costrutti per cella devono essere consegnati. La maggior parte dei vettori moderni hanno marcatori selezionabili che permettono l’uccisione selettiva delle cellule nella cultura che non sono state trasfettate o trasdotte con successo, in modo da poter sviluppare una cultura pura.

Cosa influenza la funzione e la specificità degli shRNA?

L’abbattimento ottimale del gene è un requisito per il successo dell’RNAi utilizzando sistemi shRNA. La progettazione razionale delle sequenze shRNA è stata in gran parte basata su algoritmi sviluppati con siRNA. Mentre alcune regole di progettazione siRNA si applicano a shRNA, algoritmi di progettazione shRNA più raffinati probabilmente miglioreranno il silenziamento del gene bersaglio per shRNA in futuro. Al fine di prevedere sequenze di shRNA funzionali, l’algoritmo SMARTvector™ shRNA di Dharmacon seleziona le sequenze target sulla base di numerosi criteri, comprese le preferenze nucleotidiche dipendenti dalla posizione, la struttura secondaria e i profili di stabilità termodinamica specifici dell’impalcatura basata sul microRNA SMARTvector. Inoltre, l’algoritmo SMARTvector include diversi criteri per aumentare la specificità.

Come per i siRNA, gli approcci bioinformatici possono essere applicati per creare shRNA target-specifici minimizzando il potenziale di effetti off-target. Alte concentrazioni di intermedi di silenziamento sono note per contribuire agli eventi off-target, ma il livello degli intermedi è difficile da controllare quando gli shRNA sono espressi esogenamente. Diverse pubblicazioni hanno documentato l’evidenza che, in condizioni specifiche, alti livelli di semplice espressione di shRNA stem-loop possono saturare il percorso RNAi endogeno e portare a fenotipi non voluti. Altri studi hanno suggerito che l’uso di un microRNA-adattato shRNA può ridurre la tossicità cellulare per gli esperimenti RNAi in vivo a causa di queste impalcature che vengono elaborate in modo più efficiente sia da Drosha-DGCR8 che da Dicer .

applicazioni shRNA

shRNA offre la possibilità di un silenziamento genico prolungato. La trasduzione di shRNA a base virale permette l’accesso alle cellule, come le cellule primarie e neuronali, che sono difficili da trasfettare con le strategie tradizionali basate sui lipidi cationici. Gli shRNA a base virale sono stati utilizzati anche per valutare la funzione dei geni su scala dell’intero genoma utilizzando pool di costrutti di silenziamento. Pooled o arrayed schermi sono ora ampiamente utilizzati per eseguire schermi ad alta produttività per identificare i geni richiesti in una varietà di processi come la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali, componenti della via soppressiva del tumore, modulatori dell’orologio circadiano dei mammiferi, soppressori della transizione epiteliale mesenchimale, mediatori dell’ospite della replicazione di HIV-1 e regolatori della migrazione cellulare. Il potere dello screening RNAi in pool è stato esteso anche allo screening della funzione genica in modelli animali per studiare la biologia in vivo.

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Prodotti in vetrina

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Risorse in evidenza

shRNA – Risorse

• Trova le guide ai prodotti, le FAQ e altro ancora.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Nota tecnica

• Nota tecnica che descrive il flusso di lavoro sperimentale SMARTchoice shRNA in cellule in sospensione.

SMARTvector Lentiviral shRNA – Manuale tecnico

• La piattaforma è un sistema innovativo idealmente adatto per studi RNAi-mediati.

GIPZ Lentiviral shRNA – Manuale tecnico

• Protocolli sperimentali per il knockdown genico usando GIPZ lentiviral shRNA.

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