Problemi inizialiModifica
TermolabilitàModifica
L’applicazione iniziale della ricombinasi FLP-FRT non ha funzionato nei mammiferi. La proteina FLP era termolabile (denaturata a temperature elevate) e quindi non era utile nel modello dei mammiferi a causa delle elevate temperature corporee di questi sistemi modello. Tuttavia, a causa dei brevetti e delle restrizioni sull’uso della ricombinazione Cre-Lox, è stato fatto un grande interesse per produrre una cassetta FLP-FRT più termostabile. Alcuni dei primi risultati sono stati prodotti da Buchholz et al. (1997) utilizzando la mutagenesi ciclica in Escherichia coli. Nella loro ricerca, gli autori hanno trasfettato cellule di E. coli con due plasmidi: uno che codifica per proteine FLP mutate a caso a valle di un promotore di arabinosio e un altro contenente un promotore del gene lacZ all’interno di una cassetta FRT. Gli E. coli sono stati coltivati su piastre di arabinosio a 37 °C e 40 °C, e se la ricombinazione è avvenuta, l’espressione lacZ sarebbe stata attenuata, e le colonie sarebbero apparse bianche. Le colonie bianche sono state selezionate da ogni generazione e coltivate su nuove piastre di arabinosio alle stesse temperature precedenti per otto generazioni. Dopo che la ricombinazione è stata confermata da western-blotting e i geni FLP mutati sono stati sequenziati, questa proteina FLP di ottava generazione (FLPe) è stata trasfettata in colture cellulari di mammiferi, e la ricombinazione in cellule di mammiferi è stata confermata. Questa variante di FLP ha solo 4 sostituzioni di aminoacidi: P2S, L33S, Y108N, e S294P.
Generazione di mosaici geneticiModifica
Il mosaicismo genetico si verifica all’interno di un organismo quando tipi di cellule simili esprimono fenotipi diversi a causa di genotipi dissimili a loci specifici. In parole povere, questo si verifica quando un organismo contiene genotipi diversi, cosa che di solito è rara in natura. Tuttavia, questo può essere facilmente (e problematicamente) prodotto usando la ricombinazione FLP-FRT. Se due diversi siti FRT sono presenti all’interno di una cellula, e FLP è presente in concentrazioni appropriate, la cassetta FRT continuerà ad essere escissa e inserita tra i due siti FRT. Questo processo continuerà fino a quando le proteine FLP non scenderanno al di sotto delle concentrazioni richieste, dando luogo a cellule all’interno di un organismo che possiedono genotipi diversi. Questo è stato visto dai moscerini della frutta ai topi ed è indiscriminato contro specifici cromosomi (somatici e di sesso) o tipi di cellule (somatiche e germinali).
Determinazione dei lignaggi cellulariModifica
Prima della pubblicazione di Dymecki et al. (1998), la ricombinasi Cre era stata usata per la mappatura del destino cellulare dei progenitori neuronali nei topi usando il promotore En2. Pertanto, gli autori di Dymecki et al. (1998) hanno teorizzato che la ricombinasi FLP potrebbe essere utilizzata in modo simile con un’efficacia simile alla ricombinasi Cre nei topi. Gli autori hanno creato due linee di topi transgenici: una linea di fusione neuronale Wnt1::Flp e una linea che possedeva la cassetta FRT che costeggia il 18° esone di tm1Cwr. Gli autori hanno scelto questo esone per l’escissione perché se è escisso, i suoi risultati in un fenotipo nullo. Gli autori hanno accoppiato le due linee e hanno permesso alla progenie di raggiungere l’età adulta prima che la progenie fosse sacrificata. L’estrazione dell’RNA è stata eseguita su tessuti neuronali, muscolari, enterici e della coda. La PCR a trascrizione inversa e il northern blotting hanno confermato l’escissione del 18° esone di tm1Cwr abbondantemente nel tessuto cerebrale e moderatamente nel tessuto muscolare (a causa delle cellule Scwhann all’interno del muscolo). Come previsto, l’escissione non è stata vista in altri tessuti. Gli autori hanno visto un’efficienza uguale, se non migliore, della ricombinasi FLP nella determinazione del fato cellulare rispetto alla ricombinasi Cre.
In Drosophila melanogaster (Mosca della frutta)Edit
Ad oggi, la ricombinasi Flp è stata utilizzata molte volte in D. melanogaster. Un confronto tra la ricombinasi Flp e la ricombinasi Cre in D. melanogaster è stato pubblicato da Frickenhaus et al. (2015). Gli autori di Frickenhaus et al. (2015) avevano un duplice obiettivo: caratterizzare e confrontare l’efficacia della ricombinasi Flp “knock-out” a Cre ricombinasi “knock-out” e RNAi knockdown e rivelare la funzione di cabeza (caz), l’ortologo della mosca a FUS, nei neuroni e tessuto muscolare di D. melanogaster. FUS è stato fortemente implicato nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e nella demenza frontotemporale nell’uomo. Gli autori hanno usato un sistema elav-Gal4/UAS-Flp o Cre per esprimere la ricombinasi specificamente nei neuroni e un sistema Mef2-Gal4/UAS-Flp o Cre per esprimerla specificamente nei muscoli. Gli autori concludono che lo strumento “knock-out” della ricombinasi Flp è più efficace sia della RNAi che della ricombinasi Cre allo scopo di eliminare geni specifici in tessuti o linee cellulari specifiche, a causa della mancanza della perdita di espressione vista sia nella proteina Cre che nella trascrizione RNAi. Inoltre, gli autori hanno testimoniato una tossicità per la proteina Cre che non è vista con la proteina Flp.
In Danio rerio (Zebrafish)Edit
L’efficacia del sistema di ricombinasi FLPe è stata valutata in zebrafish da Wong et al. (2009). Gli embrioni, che erano emizigoti per una proteina fluorescente verde potenziata FRT (EGFP) a valle di un promotore muscolo-specifico, sono stati iniettati con la proteina FLPe. Senza FLPe, questi embrioni dovrebbero esprimere EGFP in tutto il tessuto muscolare, e se incrociati con un filamento wild type, il 50% della progenie risultante dovrebbe esprimere EGFP anche nel tessuto muscolare. Gli embrioni, iniettati con FLPe, avevano un’espressione significativamente ridotta di EGFP nel tessuto muscolare, e si è visto anche il mosaicismo. Quando questi embrioni hanno raggiunto l’età adulta, sono stati accoppiati con un ceppo di tipo selvatico, e le covate risultanti avevano una progenie significativamente inferiore che esprimeva l’EGFP nel tessuto muscolare (0-4%). Questi risultati dimostrano che non solo FLPe è altamente efficace nelle cellule somatiche, è altamente efficace nella linea germinale di zebrafish, anche,
Nelle pianteEdit
Creazione di “fitosensori” o “sentinelle” in Arabidopsis thaliana e TobaccoEdit
I fitosensori sono piante geneticamente modificate che possono segnalare la presenza di contaminanti biotici o abiotici. Ovviamente, la produzione di queste piante ingegnerizzate è molto promettente in agricoltura e in laboratorio. Tuttavia, la creazione di un vettore reporter appropriato ha dimostrato di essere problematico. elementi cis-regolatori svolgono un ruolo importante nell’attivazione trascrizionale dei geni nelle piante, e molti non sono ben compresi. Molti fitosensori esprimono poco i loro geni reporter o riportano falsi positivi a causa di promotori sintetici. Gli autori di Rao et al. (2010) hanno utilizzato lo strumento FLP ricombinasi per la produzione di un fitosensore altamente efficiente. Gli autori hanno usato un promotore di shock termico per indurre la produzione di FLP mentre un vettore FRT-flanked ha separato il promotore CaMV 35S dal gene della beta-glucuronidasi (GUS). Quando le piante sono state esposte a shock termico, l’induzione di FLP ha portato all’escissione del vettore FRT-flanked, spostando effettivamente il gene GUS direttamente a valle del promotore CaMV 35S. L’attivazione di GUS ha portato le foglie delle piante a cambiare da verde a blu; così, il fitosensore ha efficacemente segnalato lo stress al sistema modello!
Con Cre-recombinaseEdit
Produzione del sistema di espressione MiRNA inducibile gate-way-ready (GRIM)Edit
L’interferenza RNA (RNAi) ha causato un cambiamento di paradigma nell’espressione di geni e potenziali knockout genici negli eucarioti. Prima della produzione del sistema di espressione GRIM, la creazione di vettori RNAi era costosa e richiedeva tempo. I vettori venivano prodotti con il tradizionale metodo di clonazione molecolare copia-e-incolla. Garwick-Coppens et al. (2011) hanno sviluppato un metodo molto più efficiente per la produzione di vettori RNAi in cui l’espressione dell’RNAi può essere knocked-in utilizzando Cre-recombinase e knocked-out utilizzando Flp-recombinase. Il nuovo GRIM Expression System permette la generazione molto più veloce di vettori di espressione contenenti costrutti RNAi artificiali. Gli autori hanno continuato a dimostrare che il loro sistema di espressione funziona abbastanza efficacemente in cellule di reni embrionali umani (HEK), una linea di cellule umane immortalizzate comune nella ricerca molecolare.