Regolazione della motilità da parte della coppia centrale
I cambiamenti di motilità in risposta a stimoli esterni possono assumere una delle due forme. Lo stimolo può alterare la frequenza del riorientamento casuale, come avviene nei batteri, in modo che la motilità in una direzione favorevole sia ricompensata, oppure lo stimolo può regolare direttamente la motilità in modo che l’organismo si giri in una direzione definita rispetto allo stimolo (verso lo stimolo per le tattiche positive, lontano per quelle negative). Tale tattica di rotazione richiede recettori localizzati che possono funzionare come un’antenna, e un apparato di motilità che può essere controllato direzionalmente (Foster e Smyth, 1980). Un semplice tipo di regolazione stop-reorient-start non richiede una sofisticata regolazione della motilità. Nei flagelli, il controllo direzionale richiede cambiamenti coordinati nella forma d’onda e nella frequenza di battito e quindi un apparato di regolazione più sofisticato. Il sistema di raggiera centrale a coppia adempie a questo ruolo nelle ciglia e nei flagelli 9+2, come dimostrato in modo più elegante in Chlamydomonas (Fig. 1D). Questa alga unicellulare biflagellata risponde agli stimoli fototattici alterando la forma d’onda relativa, la velocità di corsa e la frequenza di battito delle sue due flagelle (Witman, 1993). Le prove disponibili indicano che la fototassi coinvolge una via di trasduzione del segnale dall’apparato centrale, attraverso i raggi radiali, ad un complesso regolatore associato al flagello, che poi modifica il modello dell’attività della dineina e quindi della formazione e propagazione della curva attraverso cambiamenti nelle protein chinasi e fosfatasi associate alla dineina (Porter e Sale, 2000; Smith e Yang, 2004).
Mentre potrebbe esserci stato più di un modo possibile per formare un apparato centrale asimmetrico, uno costruito su un’impalcatura minima di due microtubuli potrebbe essere stato il primo ad evolversi e richiederebbe un cambiamento minimo al protocilium, principalmente l’aggiunta di un nuovo sito di inizio dell’assemblaggio nella zona di transizione insieme ad una struttura (raggio radiale) per trasmettere segnali dall’apparato centrale alle dyneine associate al doppio. Immaginiamo che i raggi radiali si siano evoluti dalla regolazione delle dyneine in fogli di doppietti, dove interagivano alle loro basi con un complesso di regolazione delle dyneine associate ai doppietti e alle loro punte con proteine associate ai microtubuli su un’altra fila di doppietti o su un citoscheletro corticale di microtubuli. Sembra notevole, data la probabilità che le dine flagellari si siano evolute dalle dine citoplasmatiche, che nessun meccanismo di regolazione comune sia noto per queste due famiglie di dine. Tuttavia, questo può riflettere la nostra attuale mancanza di conoscenza piuttosto che un’assenza di meccanismi conservati. Una recente analisi molecolare di una proteina del complesso regolatore della dineina di Chlamydomonas ha rivelato una struttura primaria che ha delle somiglianze con le proteine citoplasmatiche, ma non è stata stabilita una relazione con la dineina citoplasmatica (Rupp e Porter, 2003).
Capire i modelli specifici di interazione tra le proiezioni dai microtubuli della coppia centrale e i raggi radiali che provocano cambiamenti specifici nell’attività della dineina rimane un grande enigma. I recenti risultati del nostro laboratorio, tra cui l’analisi della normale struttura della coppia centrale, la caratterizzazione di mutanti difettosi nell’assemblaggio della coppia centrale e la determinazione dell’orientamento della coppia centrale durante la propagazione della curva, vincolano i modelli di come il CP regola la dineina. Qui cerchiamo di sintetizzare un’ipotesi di regolazione della coppia centrale coerente con questi risultati.
Precedenti microscopie elettroniche a sezione sottile di assonemi di Chlamydomonas e Tetrahymena, insieme a preparazioni di macchie negative di complessi di coppia centrale da cilia di Tetrahymena (Chasey, 1969) e flagelli di sperma di ratto (Olson e Linck, 1977) hanno rivelato la struttura asimmetrica dei complessi di coppia centrale e definito il microtubulo CP con proiezioni più lunghe in sezione trasversale e periodicità di 32 nm come C1, mentre l’altro (C2) ha proiezioni più corte con solo 16 nm di ripetizioni. Confrontando sezioni sottili trasversali e longitudinali di complessi di coppia centrale wild type con complessi di coppia centrale da mutanti di assemblaggio pf6 e cpc1, ho determinato le relazioni strutturali e i periodi di ripetizione per la maggior parte delle proiezioni C1 e C2-associate in Chlamydomonas. Le viste di superficie fornite da immagini stereo di preparazioni surgelate e incise in profondità hanno confermato e ampliato queste conclusioni e hanno portato a una ricostruzione 3-d abbastanza completa della coppia centrale (Mitchell, 2003a). Questi studi forniscono un modello dei potenziali siti di interazione dei raggi sulla coppia centrale, e in particolare mostrano discontinuità nella superficie altrimenti cilindrica della CP lungo le superfici dei microtubuli che si rivolgono verso le teste dei raggi adiacenti. Viene anche sottolineata l’asimmetria complessiva del complesso CP, che suggerisce interazioni uniche del raggio in diverse posizioni radiali intorno al cilindro CP. Il clonaggio dei geni pf6 (Rupp et al., 2001) e cpc1 (Mitchell e Sale, 1999; Zhang e Mitchell, 2004) e l’identificazione dei loro prodotti genici non hanno identificato candidati ovvi per proteine che interagiscono con i raggi radiali, ma una proteina simile alla kinesina (Klp1) sul microtubulo C2 (Bernstein et al., 1994) è un candidato attraente per una proteina legante i raggi. Abbiamo recentemente dimostrato che i flagelli nelle cellule knockdown di Klp1 battono con frequenze drammaticamente ridotte (Mitchell e Yokoyama, 2003).
Gli studi EM mostrano che il CP mantiene un orientamento fisso rispetto al corpo cellulare e ai doppietti esterni in alcuni organismi, mentre in altri il CP ha un orientamento variabile. Filogeneticamente, l’orientamento fisso sembra essere una semplificazione derivata negli organelli che hanno un piano di curvatura fisso, come le cilia a pettine di ctenoforo (Tamm e Tamm, 1981) e molti spermatozoi metazoi (Sale, 1986). In esempi estremi, i microtubuli C1 e C2 sono attaccati ai doppietti 8 e 3, rispettivamente, da collegamenti permanenti (raggi modificati o strutture accessorie). All’estremo opposto ci sono le ciglia e i flagelli degli organismi unicellulari che si affidano a rapidi cambiamenti nella forma d’onda, nella frequenza di battito e nell’orientamento effettivo della corsa per rispondere agli spunti ambientali. Le CP in questi organelli sono contorte, così che non mantengono un orientamento fisso dalla base alla punta all’interno dei 9 doppietti circostanti. Inoltre, questi CP contorti ruotano durante la propagazione della curva (Omoto et al., 1999). Abbiamo recentemente dimostrato che il CP di Chlamydomonas è orientato parallelamente al piano della curva all’interno di ogni curva (Fig. 1D), e si torce di 180° tra le successive curve principali e inverse, e che il microtubulo C1 è sempre più vicino ai doppietti sul lato esterno di ogni curva (Mitchell, 2003b). Questo orientamento costante del CP rispetto a una curva in Chlamydomonas permette a una serie di proiezioni CP di interagire con raggi radiali attaccati a doppietti con dineine attive, mentre un’altra serie di proiezioni CP interagisce con raggi radiali su doppietti con dineine inattive.
Anche se l’involucro del battito è quasi planare in Chlamydomonas, e la direzione delle curve principali non cambia drammaticamente lontano da un piano costante, questo non è vero in altri organismi. Se l’orientamento CP segue anche l’orientamento della curva in questi altri organismi, come propongo, allora il CP è sempre posizionato per fornire un controllo flessibile della motilità. I nostri recenti risultati indicano che l’orientamento del CP si conforma passivamente alle curve che si formano alla base di un flagello di Chlamydomonas, e poi questo orientamento dipendente dalla curva si trasferisce man mano che ogni curva si propaga dalla base alla punta. Un’analogia con l’ingegneria è un ingranaggio a vite senza fine, in cui la rotazione del verme (coppia centrale) è legata al movimento perpendicolare (propagazione della curva) degli ingranaggi interdigitanti di un ingranaggio dentato (curve assonemiche). La direzione di una curva principale non può quindi essere determinata dall’orientamento della coppia centrale, che si conforma passivamente alle curve, ma deve essere regolata a livello del doppietto esterno, attraverso modelli di iniziazione alla base del flagello. I segnali regolatori dal CP possono quindi determinare la forma e la frequenza di battito attraverso la modulazione diretta dei modelli di attività della dineina all’interno delle curve in sviluppo e in propagazione. Questa ipotesi è coerente con i risultati del riorientamento vibrazionale del piano di battito degli assonemi dei ricci di mare (Shingyoji et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Se il nuovo piano di curvatura indotto dalla vibrazione forza un nuovo orientamento della coppia centrale, allora il rilassamento del sistema dopo la rimozione della vibrazione imposta da queste cellule richiederebbe una graduale rotazione della coppia centrale di nuovo alla sua posizione di riposo. Sfortunatamente, le informazioni sull’effettivo orientamento della CP non sono state ottenute in quegli esperimenti. Questa ipotesi è anche coerente con il modello di scorrimento dei doppietti osservato negli assonemi di Chlamydomonas trattati con proteasi, in cui i modelli di scorrimento dei doppietti mantengono una relazione costante con l’orientamento della coppia centrale (Wargo e Smith, 2003; Wargo et al, 2004), e con studi sull’attività della dineina in assonemi danneggiati di Chlamydomonas (Smith, 2002) e di riccio di mare (Yoshimura e Shingyoji, 1999; Nakano et al., 2003), che mostrano una modulazione dell’attività dipendente dal calcio e dalla coppia centrale.
Di che valore predittivo sono queste speculazioni sull’evoluzione di ciglia e flagelli? In primo luogo, ipotizziamo che lo sviluppo della motilità superficiale dei flagelli sia primitivo e probabile che si incontri in generale, anche nei derivati ciliari che non battono. Chiaramente l’IFT è una motilità essenziale e universale per l’assemblaggio di organelli sia mobili che non mobili, quindi il collegamento di questo macchinario al movimento extracellulare può essere altrettanto diffuso. In secondo luogo, il sequestro dei recettori sulle membrane ciliari è anche primitivo, e probabilmente è un’importante pressione selettiva per la continuazione dell’esistenza delle ciglia primarie non mobili, così come delle ciglia più altamente modificate degli organi sensoriali. Poiché i derivati ciliari forniscono funzioni essenziali nei neuroni sensoriali di molti organismi, è necessario solo un piccolo salto di immaginazione per suggerire che il protocilium ha anche formato la piattaforma ancestrale per tutti i processi sensoriali, e che ulteriori caratteristiche di questo organello possono essere comuni nelle cascate di trasduzione sensoriale. In terzo luogo, anche l’orientamento del centrosoma come indicatore della polarità cellulare e della direzione di migrazione per le cellule mobili è molto primitivo. Se è così, l’importanza del protocilium come determinante precoce della polarità cellulare e della migrazione diretta suggerisce che si dovrebbero cercare più collegamenti tra i meccanismi che determinano la polarità cellulare e i meccanismi che orientano i centrosomi/centrioli insieme alla matrice citoplasmatica dei microtubuli. Infine, anche la regolazione delle ciglia e dei flagelli da parte della coppia centrale deve essersi sviluppata molto presto nell’evoluzione eucariotica, prima della radiazione di tutti i phyla eucariotici esistenti. Anche se esistono indubbiamente differenze nella regolazione dettagliata richiesta da questi organelli in diversi organismi e tipi di cellule, dovremmo aspettarci di trovare molti tratti universali nel modo in cui le interazioni coppia centrale-raggi regolano l’attività della dineina, e potremmo ancora trovare temi comuni nella regolazione dei motori assonemici e citoplasmatici della dineina.