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Risultati rappresentativi

La capacità dei saggi a placche di valutare accuratamente i titoli virali si basa su numerosi fattori: selezione appropriata delle cellule ospiti, mezzi e condizioni di crescita adeguati per la vitalità cellulare e virale, propagazione virale immobilizzata e una determinazione accurata del periodo di incubazione virale per consentire un tempo adeguato per la formazione di placche distinte e conteggiabili.

Per questo studio, sono stati scelti virus di tre famiglie rappresentative per dimostrare le differenze in: selezione della sovrapposizione, periodi di incubazione e morfologia delle placche in diversi tipi di campioni. L’encefalite equina venezuelana (VEEV) è stata selezionata come modello virale (+)ssRNA, che può causare malattie significative nelle specie equine e nell’uomo e rappresenta la famiglia Togaviridae. Il ceppo Influenza B Taiwan, un virus segmentato (-)ssRNA che infetta principalmente l’uomo, rappresenta la famiglia Orthomyxoviridae. Il virus della febbre della Rift Valley (RVFV), un virus (-)ssRNA nato da artropodi che infetta principalmente artropodi, ruminanti ed esseri umani, è stato selezionato come rappresentante della famiglia Bunyaviridae.

Per RVFV (Figura 1), i titoli sono stati determinati da una soluzione stock di un ceppo ricombinante MP12 attenuato vivo di RVFV in un formato di piastra a 12 pozzetti utilizzando CMC, agarosio o Avicel che sono stati incubati fianco a fianco per 72 ore post infezione (hpi). Una piastra rappresentativa che mostra diluizioni che vanno da 10-4 a 10-7 può essere visto nel pannello A. Placche utilizzando CMC e sovrapposizioni agarosio mostrato piccole, chiare e distinte placche con un ben definito bordo circolare. Le placche con una sovrapposizione liquida erano leggermente più abbondanti e più grandi rispetto alle placche di agarosio e CMC e fornivano un bordo meno distinto. Titoli virali sono stati confrontati nel pannello B con tutte le sovrapposizioni eseguendo comparabilmente.

Al fine di ottenere un confronto visivo più chiaro tra sovrapposizioni per MP12 insieme a una dimensione del campione più grande per determinare la riproducibilità, una piastra di 6 pozzetti è stato anche provato in triplicato (Figura 2). Nel formato della piastra da 6 pozzetti, l’uso di una sovrapposizione CMC ha mostrato placche più piccole rispetto alle sovrapposizioni in agarosio o liquide, che erano paragonabili per dimensioni l’una all’altra. Mentre i titoli virali erano simili tra tutti e tre overlay (pannello D), placche formate in agarosio e liquido overlay dimostrato più facile da contare a causa della loro maggiore dimensione.

In contrasto con RVFV, VEEV titoli e morfologia della placca tra i diversi overlay variava notevolmente (Figura 3A). Le placche formate nelle sovrapposizioni CMC hanno dimostrato una morfologia chiara e distinta quando si utilizza un formato di piastra a 12 pozzetti, a scapito delle dimensioni della placca e della sensibilità (pannello B). In contrasto con la CMC, l’uso di sovrapposizioni di agarosio e liquido ha portato a placche significativamente più grandi, indicando una minore inibizione virale e una maggiore sensibilità alla replicazione del VEEV. Questo è stato precedentemente confermato quando si confronta solo l’agarosio rispetto alla CMC in un articolo pubblicato da Juarez et al.4. Mentre l’agarosio e le sovrapposizioni liquide hanno prodotto placche più grandi rispetto alla CMC, le placche avevano bordi poco definiti ed erano difficili da contare in un formato a 12 pozzetti, con le sovrapposizioni liquide che fornivano la maggiore diffusione dei bordi. Quando le placche sono state provate in piastre da 6 pozzetti (Figura 4), il più grande formato da 6 pozzetti ha negato il problema delle placche troppo grandi che erano difficili da differenziare nel formato da 12 pozzetti, con sovrapposizioni di agarosio e liquido dimostrando superiore alle sovrapposizioni CMC in termini di definizione della placca e sensibilmente (Figura 4D).

In confronto a RVFV o VEEV, influenza fornisce diverse sfide uniche quando placca, come il requisito di una proteasi esterna. La sensibilità del virus dell’influenza a diverse selezioni overlay è stato anche ben documentato in passato come cambiamenti significativi sono stati notati quando modifiche minori come diverse marche di agarosio sono stati utilizzati 9.

Interessante per il ceppo di Influenza B Taiwan, l’uso di CMC come un overlay ha portato a marcatamente più piccole placche che erano difficili da contare e dimostrato difficile da punteggio affidabile (Figura 5A). L’uso di una sovrapposizione di agarosio fornito le migliori placche (pannello C), e ha portato a una macchia di sfondo più scuro (probabilmente a causa di una maggiore vitalità monostrato), e ha mostrato placche più chiare e più nitide in confronto diretto con l’uso della sovrapposizione liquido (pannello B).

Un vantaggio distinto di polimeri liquidi sopra sovrapposizioni solide e semisolide, come agarosio e CMC, sta nella facilità di rimozione e applicazione. Le sovrapposizioni semisolide richiedono il riscaldamento e la solidificazione può rivelarsi problematica durante la manipolazione e la rimozione. Al fine di capitalizzare questi vantaggi e per determinare la praticità di utilizzare Avicel in un modo ad alta produttività per RVFV, un formato di piastra 96 pozzetti è stato provato a varie concentrazioni di sovrapposizione (Figura 6). Per RVFV MP-12, le diluizioni sono state eseguite in quadruplicato sia a 0,6 e 1,2% concentrazioni finali di Avicel. Applicazione di sovrapposizione e la rimozione si è rivelato semplice, senza differenze apparenti tra i replicati o tra le concentrazioni notato, dimostrando un elevato grado di riproducibilità. Quando punteggio, placche erano distinti e contati ad occhio nudo, dimostrando la fattibilità di utilizzare sovrapposizioni liquido in un modo ad alta produttività per RVFV.

Figura 1: RVFV placca sovrapposizione confronti utilizzando 12 piatti bene. I veros sono stati placcati a 2,5 x 105 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 µl usando lo stesso campione iniziale di MP12 diluito in serie. Dopo l’infezione sono stati applicati 1,5 ml di sovrapposizioni di 0,3% agarosio, 0,6% Avicel, o 1% CMC (concentrazioni finali), al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel pannello A. Le placche sono state contate e titolate nel pannello B.

Figura 2: Confronti delle placche di RVFV utilizzando piastre da 6 pozzetti. I veros sono stati placcati a 5 x 105 cellule in piastre da 6 pozzetti e infettati con 400 µl utilizzando lo stesso campione iniziale di MP12 diluito in serie. Tre ml di sovrapposizioni di 0,3% agarosio, 0,6% Avicel, o 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel pannello A, B, e C. Esperimenti separati sono stati eseguiti in modo identico come descritto per i pannelli A-C, con placche contati e titolati nel pannello D (N = 3).

Figura 3: VEEV placca confronti sovrapposizione utilizzando 12 piastre bene. I veros sono stati placcati a 2,5 x 105 cellule in piastre da 12 pozzetti e infettati con 200 µl usando lo stesso campione iniziale diluito in serie del ceppo del vaccino VEEV TC-83. Dopo l’infezione sono stati applicati 1,5 ml di sovrapposizioni di agarosio allo 0,3%, Avicel allo 0,6% o CMC all’1% per confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel pannello A. Le placche sono state contate e titolate nel pannello B.

Figura 4: Confronti di sovrapposizioni di placche VEEV utilizzando piastre a 6 pozzetti. I Veros sono stati placcati a 5 x 105 cellule in piastre da 6 pozzetti e infettati con 400 µl usando lo stesso campione iniziale di VEEV TC-83 diluito in serie. Dopo l’infezione, 3 ml di sovrapposizioni di 0,3% agarosio, 0,6% Avicel, o un 1% CMC, sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nei pannelli A, B e C. Esperimenti separati sono stati eseguiti in modo identico come descritto per i pannelli A – C, con placche contati e titolati nel pannello D (N = 3).

Figura 5:Influenza placca sovrapposizione confronti. Le cellule MDCK sono state placcate a 5 x 105 cellule in piastre da 6 pozzetti e infettate con 400 µl di inoculo usando lo stesso campione iniziale di Influenza B Taiwan diluito in serie. Nessun siero bovino fetale (FBS) è stato usato nei mezzi di crescita o negli overlay, poiché il FBS può inibire la propagazione dell’influenza attraverso l’inibizione di alcune proteasi che sono necessarie per la fusione virale. TPCK-tripsina è stato aggiunto a tutte le sovrapposizioni prima dell’applicazione al fine di facilitare la fusione virale e l’ingresso con le cellule ospiti. Dopo l’infezione, 3 ml di sovrapposizioni di 0,3% agarosio, 0,6% Avicel, o 1% CMC sono stati applicati al fine di confrontare direttamente le sovrapposizioni come dimostrato nel pannello A, B e C. Esperimenti separati sono stati eseguiti in modo identico come descritto nei pannelli A – C, con placche contate e titolate nel pannello D (N = 3). Mentre una media è stata presa per le placche CMC si sono rivelati difficili da contare in modo affidabile come hanno dimostrato confini diffusi e dimensioni molto piccole placca.

Figura 6: Alta capacità di sovrapposizione placca. Una piastra a 96 pozzetti di Veros placcata a 3 x 104 cellule per pozzetto, sono state infettate con 50 µl di inoculo utilizzando lo stesso campione iniziale di RVFV MP12 diluito in serie per 1 ora, in quadruplicato. Per le sovrapposizioni, sono state provate concentrazioni finali di Avicel dello 0,6 e dell’1,2% per determinare la fattibilità e la riproducibilità dell’utilizzo di sovrapposizioni liquide in un modo ad alta produttività, pannelli A e B.

Tabella 1:Saggio della placca Condizioni di inoculazione e tipi di cellule

Tabella 2:Placca e media di crescita virale/cellulare

Le soluzioni di copertura non scadono una volta prodotte, purché sia mantenuta la sterilità.

Tabella 3:Stock overlay

Tabella 4: Formati delle piastre