Una procedura generale di blotting inizia con l’estrazione dell’RNA totale da un campione di tessuto omogeneizzato o da cellule. L’mRNA eucariotico può quindi essere isolato attraverso l’uso della cromatografia con cellulosa oligo (dT) per isolare solo gli RNA con una coda poly(A). I campioni di RNA sono poi separati mediante elettroforesi su gel. Poiché i gel sono fragili e le sonde non sono in grado di entrare nella matrice, i campioni di RNA, ora separati per dimensione, vengono trasferiti su una membrana di nylon attraverso un sistema di blotting capillare o a vuoto.
Impostazione del sistema di blotting capillare per il trasferimento di RNA da un gel per elettroforesi a una membrana di blotting.
Una membrana di nylon con una carica positiva è la più efficace da usare nel northern blotting poiché gli acidi nucleici con carica negativa hanno un’alta affinità per essa. Il tampone di trasferimento usato per il blotting di solito contiene formamide perché abbassa la temperatura di annealing dell’interazione sonda-RNA, eliminando così la necessità di alte temperature, che potrebbero causare la degradazione dell’RNA. Una volta che l’RNA è stato trasferito sulla membrana, viene immobilizzato attraverso un legame covalente alla membrana mediante luce UV o calore. Dopo che una sonda è stata etichettata, viene ibridata all’RNA sulla membrana. Le condizioni sperimentali che possono influenzare l’efficienza e la specificità dell’ibridazione includono la forza ionica, la viscosità, la lunghezza del duplex, le coppie di basi spaiate e la composizione delle basi. La membrana viene lavata per assicurarsi che la sonda si sia legata in modo specifico e per evitare l’insorgere di segnali di fondo. I segnali ibridi sono poi rilevati da una pellicola a raggi X e possono essere quantificati dalla densitometria. Per creare controlli per il confronto in un northern blot, i campioni che non mostrano il prodotto genico di interesse possono essere utilizzati dopo la determinazione tramite microarray o RT-PCR.
GelsEdit
RNA eseguito su un gel di agarosio formaldeide per evidenziare le subunità ribosomiali 28S (banda superiore) e 18S (banda inferiore).
I campioni di RNA sono più comunemente separati su gel di agarosio contenenti formaldeide come agente denaturante per l’RNA per limitare la struttura secondaria. I gel possono essere colorati con bromuro di etidio (EtBr) e visti sotto la luce UV per osservare la qualità e la quantità di RNA prima del blotting. L’elettroforesi su gel di poliacrilammide con urea può anche essere usata nella separazione dell’RNA, ma è più comunemente usata per RNA frammentato o microRNA. Una scala di RNA viene spesso eseguita accanto ai campioni su un gel di elettroforesi per osservare la dimensione dei frammenti ottenuti, ma nei campioni di RNA totale le subunità ribosomiali possono agire come marcatori di dimensione. Poiché la grande subunità ribosomiale è 28S (circa 5kb) e la piccola subunità ribosomiale è 18S (circa 2kb), due bande prominenti appaiono sul gel, la più grande con un’intensità quasi doppia della più piccola.
SondeModifica
Le sonde per il northern blotting sono composte da acidi nucleici con una sequenza complementare a tutto o parte dell’RNA di interesse, possono essere DNA, RNA, o oligonucleotidi con un minimo di 25 basi complementari alla sequenza target. Le sonde a RNA (riboprobe) che vengono trascritte in vitro sono in grado di sopportare fasi di lavaggio più rigorose evitando parte del rumore di fondo. Comunemente il cDNA viene creato con primer etichettati per la sequenza di RNA di interesse per agire come sonda nel northern blot. Le sonde devono essere etichettate con isotopi radioattivi (32P) o con la chemiluminescenza in cui la fosfatasi alcalina o la perossidasi di rafano (HRP) scompongono i substrati chemiluminescenti producendo un’emissione rilevabile di luce. L’etichettatura chemiluminescente può avvenire in due modi: o la sonda è attaccata all’enzima, o la sonda è etichettata con un ligando (per esempio biotina) per cui il ligando (per esempio avidina o streptavidina) è attaccato all’enzima (per esempio HRP). La pellicola a raggi X può rilevare sia i segnali radioattivi che quelli chemiluminescenti e molti ricercatori preferiscono i segnali chemiluminescenti perché sono più veloci, più sensibili e riducono i pericoli per la salute che accompagnano le etichette radioattive. La stessa membrana può essere sondata fino a cinque volte senza una perdita significativa dell’RNA bersaglio.