Questa confusione, in particolare nel regno biofarmaceutico degli antigeni infettivi e in particolare dei virus, porta a situazioni di non padronanza tecnica, di non conformità e, in ultima analisi, di aumento del rischio di contaminazione incrociata tra prodotti. Tutto ciò sottolinea l’importanza della chiarezza nel biocontenimento.
Nei primi anni 2000, a causa di pressioni esterne, l’industria è stata obbligata a rimuovere la formalina (CMR) che era ampiamente utilizzata come reagente di decontaminazione. L’adozione di reagenti di decontaminazione alternativi ha evidenziato tre punti principali: (i) la decontaminazione storica ha esposto la relativa inefficacia della formalina alla luce delle pratiche attuali; (ii) convalidare l’efficienza delle prestazioni dei decontaminanti è difficile (troppi fattori variabili esterni che ne influenzano le prestazioni); (iii) ha evidenziato la necessità di una revisione approfondita delle prestazioni di tutti gli strumenti e dei processi di decontaminazione. Queste osservazioni sono ulteriormente supportate dalle ambizioni di eradicazione della polio condotte dall’OMS (GAP-III) che ha anche evidenziato queste lacune e debolezze.
Al giorno d’oggi, le tecnologie associate ai diversi metodi di decontaminazione (fisica, termica, chimica) sono numerose, e forniscono un ampio pannello di scelte che possono essere impiegate nelle industrie biofarmaceutiche, e soprattutto nelle aziende di vaccini. Di conseguenza, il dovere di padronanza e di convalida delle prestazioni dei processi di decontaminazione non è più un’opzione (!) Tuttavia, nuovi vincoli stanno emergendo e richiedono notevoli risorse umane e tecniche che hanno un impatto sui costi del progetto, forse esponenzialmente in esecuzione in milioni di euro!
Questo articolo mira a servire come una “lezione imparata” e si basa su molti anni di indagini di decontaminazione alternativa. L’articolo condivide anche la strategia, inizialmente concepita nel 2004, che è stata progettata per anticipare il nuovo paradigma dello stato dell’arte della decontaminazione. Infine, questo articolo mira a partecipare all’educazione su questo argomento spesso frainteso e spesso trascurato…
Definizioni
È importante chiarire le definizioni farmaceutiche di “pulizia” e “disinfezione”, e ulteriori chiarimenti possono essere evidenziati da esempi.
Pulizia
Risultato di un’operazione in un tempo limitato, permettendo il ritiro di tutti i composti inerti indesiderabili acquisiti sulle superfici contaminate secondo gli obiettivi stabiliti. Il risultato di questa operazione è limitato ai composti presenti al momento delle operazioni.
Questi composti provengono da fonti ambientali naturali o dal prodotto manipolato.
Gli obiettivi perseguiti dalla PULIZIA sono composti inerti (aree di produzione o di laboratorio)
Disinfezione:
Risultato di un’operazione in un tempo limitato, che permette di ritirare, inattivare o uccidere tutti i microrganismi indesiderabili portati da mezzi inerti contaminati secondo gli obiettivi stabiliti. Il risultato di questa operazione è limitato ai microrganismi presenti al momento delle operazioni (AFNOR NFT 72-101).
Questi microrganismi non sono specifici e provengono da fonti ambientali naturali.
Gli obiettivi della DISINFEZIONE sono i microrganismi ambientali (aree di produzione o di laboratorio).
La definizione di decontaminazione può derivare dalle due precedenti:
Decontaminazione:
Risultato di un’operazione in un tempo limitato, che permette di inattivare, uccidere o distruggere tutti i microrganismi specifici trattati secondo gli obiettivi stabiliti. Questi microrganismi sono noti e specifici.
Gli obiettivi perseguiti dalla DECONTAMINAZIONE sono il controllo della diffusione dei microrganismi specifici (prodotti vaccinali o microrganismi manipolati in laboratorio)
In conclusione, l’uso del termine disinfezione come sinonimo di decontaminazione deve essere vietato. Infine, la pulizia non assicura la disinfezione o la decontaminazione. Allo stesso modo, la disinfezione non assicura la decontaminazione o la pulizia.
Strategia di decontaminazione virale
Considerando tutte le tecnologie di decontaminazione (tecnologie fisiche, reagenti chimici…) con meccanismi diversi, che chiameremo “Armi” (vedi tabelle 1 & 2) e l’enorme numero di virus, che chiameremo “Obiettivi”, la lista delle convalide da effettuare può diventare ingestibile, lunga e dai costi proibitivi.
| Modalità chimiche | |
| Reagenti liquidi | Decontaminazione in profondità e/o in superficie |
| Gassosa | Decontaminazione principalmente superficiale |
| Modi fisici | |
| Radiazioni | In profondità e decontaminazione superficiale |
| (pulsato) Luce | In profondità e/o decontaminazione superficiale |
| e-fascio | (principalmente) Decontaminazione superficiale |
| Modi termici | Utilizzati principalmente per la decontaminazione in profondità |
| (Autoclavi, Forno) | |
Tabella 1: Modalità di decontaminazione, che chiameremo le “Armi”
Sfortunatamente, i virus suscitano proprietà interessanti come (i) la loro incapacità di generare mutazioni resistenti contro i reagenti chimici (perché la mutazione resistente può essere acquisita solo durante la loro replicazione virale che non è il caso qui) (ii) la loro composizione con 4 composti di base, acidi nucleici, aminoacidi, zuccheri e lipidi che essenzialmente trasformano i virus in semplici bersagli chimici piuttosto che virus “spaventosi”.
Considerando questi nuovi paradigmi di proprietà virali, emergono possibilità che includono una “strategia di parentesi” per creare modelli di virus che rappresentano i peggiori scenari. Ovviamente, la regola del bracketing non può essere generalizzata in modo assoluto, ma può essere legata a un chiaro e forte razionale scientifico, a una lista di criteri specifici e anche a una lista di virus considerati. Nell’esempio seguente, saranno analizzati 9 virus trattati abitualmente in un’azienda di vaccini (tabella 3).
Dopo aver identificato i bersagli e le armi, si dovranno identificare tutti i “Vincoli”.
Dal lato dei bersagli:
La disponibilità del bersaglio (cioè), la disponibilità del laboratorio per la manipolazione (contenimento della biosicurezza), la disponibilità dei metodi di quantificazione: sono disponibili, se sì, quali sono i loro limiti di rilevamento, la loro robustezza (matrice viro e/o citotossicità)?
| Modi / Reagenti | Obiettivo/i principale/i sulla struttura virale |
| Temperatura | Involucro virale, (glico)proteine, RNA poi DNA |
| Acidi / Basi | Involucro virale, (Glyco)proteine |
| Alcoli / Etere | Involucro virale, (Glyco)proteine |
| Ossidanti (Cl- , O3, H2O2, formalina, b-propiolattone…) |
Involucro virale, (glico)proteine, acidi nucleici |
| Detergenti (ionici / non ionici) | Involucro virale |
| UV / p-Light | Acidi nucleici, (Glyco)proteine |
Tabella 2: Modalità di decontaminazione contro elementi biochimici virali: impatto sulla struttura virale
Dalla parte delle Armi:
Sono disponibili composizioni di reagenti chimici? (cioè natura e concentrazione di ogni componente)? Sono disponibili i reagenti neutralizzanti corrispondenti? Qual è il loro impatto sui metodi di quantificazione a causa della citotossicità?
A causa dei vincoli dell’obiettivo (suscettibilità, livello di concentrazione, sistemi di espressione…), una delle strategie è quella di raggruppare i microrganismi per definire il miglior modello che sarà in grado di coprire un numero massimo di essi e permetterà di definire i parametri di decontaminazione efficaci. Il modello di microrganismo selezionato deve essere derivato da almeno 3 criteri principali (i) un’analisi dei rischi con regole di raggruppamento ben definite. (ii) la disponibilità fisica del modello del microrganismo potenziale, compreso il livello di titolo infettivo compatibile con gli obiettivi finali, e iii) il metodo di quantificazione utilizzato (limite di rilevamento più basso, la sua precisione a basso livello, la robustezza…).
Consapevoli di tutti questi elementi chiave, le specifiche di efficienza dovrebbero essere stabilite. Purtroppo mancano indicazioni normative chiare ed esaustive (francesi, europee, statunitensi, internazionali…) e, se fornite, sono limitate e non coprono tutti i casi, soprattutto per i virus (tabella 4). Per quanto riguarda ogni modalità di decontaminazione, le specifiche normative non sono così chiare e spesso derivano da esperienze di garanzia della sterilità, come la famosa “riduzione di 6 log”.
Specificamente per gli obiettivi virali, si può trovare una riduzione di 4 log del titolo infettivo utilizzando la modalità chimica, ma nella maggior parte dei casi virali, non è appropriata. Questo ci porta alle seguenti domande: quali sono le specifiche giuste per (i) la decontaminazione delle superfici, (ii) i rifiuti liquidi, (iii) i rifiuti solidi, (iv) l’aria? Senza questa guida, è necessario almeno uno studio bibliografico.
La maggior parte delle volte, i parametri di efficienza dichiarati sull’etichetta per i prodotti di decontaminazione pronti all’uso non sono appropriati a causa di una grande assenza di informazioni metodologiche come le condizioni ambientali, l’approccio scientifico e i requisiti minimi di prestazione (ad es. 4 Log di riduzione legati a una norma…)
| Composizione strutturale | |||||
| Virus | Punte esterne: glicoproteina | Involucro: fosfolipidi |
Core: proteine | Genere : ARN | Conclusioni secondo le regole della “bracketing strategy” |
| Poliovirus (Enterovirus) | No | No | Sì | Sì | Virus nel gruppo 1 Modello rappresentato da Poliovirus |
| Epatite A (Enterovirus) | No | No | Sì | Sì | |
| Virus dell’influenza (Flu) | Sì | Sì | Sì | Sì | Virus del gruppo 2 Modello rappresentato dal virus dell’influenza |
| Morbillo (Morbilivirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
| Virus della parotite (Rubulavirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
| Virus della rosolia (Rubivirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
| Virus della rabbia (Lyssavirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
| Y-Febbre (Flavivirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
| Dengue (Flavivirus) | Sì | Sì | Sì | Sì | |
Tabella 3: Elenco dei 9 virus considerati, che chiameremo “Targets”
In base alla struttura biochimica di ogni virus, qui possiamo definire 2 modelli, secondo le seguenti caratteristiche e i “vincoli” che sono stati identificati nelle regole specifiche stabilite
Finalmente le strategie di validazione possono essere riassunte come segue: L’arma giusta contro il bersaglio giusto con la migliore cassetta degli attrezzi, che deve essere definita in modo specifico. In ogni caso, tutte le (vostre) specifiche devono essere impostate in relazione ad ogni uso specifico.
| Specifiche di decontaminazione chimica liquida | |||
| Battericida | Norma francese | AFNOR NF T 72-170 e 171 | 5 Log riduzione |
| Norma europea | NF EN 1040 | ||
| Sporicida | Norma francese | AFNOR NF T 72-230 e 231 | 5 Log di riduzione |
| Fungicida | Norma francese | AFNOR NF T 72-200 e 201 | 4 Riduzione Log |
| Norma Europea | NF EN 1275 | ||
| Virucida | Norma Francese | AFNOR NF T 72-180, 181 e 185 | 4 Riduzione del log |
| Norma europea | NF EN, 14675/14476 e 13610 | ||
| Specifiche per la decontaminazione chimica dell’aria | |||
Battericida 5 Log riduzioneSporicida Norma francese AFNOR NF T 72-2813 Log riduzioneFungicida 4 Log riduzioneVirucida 4 Log riduzione
(Nuovo! Nov.14)
Tabella 4: esempi di norme per l’impostazione delle specifiche
Dopo più di 10 anni di esperienza, la nostra lezione ha fornito una preziosa esperienza positiva. Tutti i (nostri) virus sono collegati ai loro parametri di decontaminazione efficienti e convalidati, in un sistema conforme, coerente e robusto, mentre realizziamo dei risparmi grazie al nostro approccio. Ora ogni nuovo potenziale reagente di decontaminazione è facile da convalidare e un aggiornamento completo del nostro sistema di decontaminazione per tutti i virus può essere eseguito in pochi esperimenti. Inoltre, la strategia è stata verificata con le autorità di regolamentazione con conseguente aumento della conformità senza osservazioni significative.
La sfida rimanente, è quello di educare i revisori che non sono tutti familiarità con i virus riducendo le loro nozioni preconcette di complessità virale permettendo così piena approvazione delle prestazioni e l’efficienza di questi approcci e dati.