3.1 OMV: Composizione, biogenesi e ruoli funzionali
Le OMV sono nanostrutture sferiche resistenti e discrete a doppio strato lipidico, di diametro compreso tra 10 e 300 nm, derivate dall’involucro cellulare e incapaci di replicarsi autonomamente (Kulp e Kuehn, 2010; Huang et al., 2016) (Fig. 4). Il distacco delle OMV è stato osservato per la prima volta più di 50 anni fa nelle micrografie elettroniche a trasmissione che raffigurano l’ultrastruttura della parete cellulare batterica (Bladen e Waters, 1963; Bayer e Anderson, 1965; Chatterjee e Das, 1967). Fu stabilito che queste strutture nanosferiche comprendevano una singola membrana che circondava un centro denso di elettroni (Work et al., 1966). Altri studi dello stesso periodo riportarono anche la presenza di “globuli extracellulari” nel surnatante privo di cellule di E. coli coltivato in condizioni di crescita con limitazione dei nutrienti (Bishop e Work, 1965; Knox et al., 1966; Work et al., 1966). Pertanto, è stato inizialmente postulato che la formazione di OMV si verificasse solo in condizioni di stress. Tuttavia, ulteriori indagini hanno chiaramente dimostrato che le OMV possono essere rilevate anche in condizioni non stressanti, sia in laboratorio che in ambiente (Hoekstra et al., 1976; Hellman et al., 2000). Oggi, è noto che le OMV contribuiscono a una miriade di funzioni biologiche chiave, e uno dei primi ruoli mai descritti per le OMV è il loro coinvolgimento nella patogenesi, in particolare come veicoli di consegna di fattori di virulenza (rivisto in Ellis e Kuehn, 2010). Nel corso degli anni, ulteriori funzioni sono state attribuite agli OMV, a seconda della specie e delle condizioni di coltura, tra cui la comunicazione intra/interspecie, la reattività agli stress dell’involucro, l’acquisizione di nutrienti, il trasferimento genico orizzontale, l’agire come agenti “esca” e come beni pubblici (per una descrizione dettagliata, vedi Kulp e Kuehn, 2010 e Schwechheimer e Kuehn, 2015). In generale, le OMV sembrano promuovere la sopravvivenza del batterio all’interno di una specifica nicchia ambientale, il che evidenzia la loro rilevanza per l’omeostasi batterica.
Fig. 4. Vescicole di membrana esterna di batteri Gram-negativi. (A) Rappresentazione di una vescicola di membrana esterna (OMV- pannello superiore) derivata dall’involucro cellulare batterico (pannello inferiore). Dettagli della membrana esterna (OM) e membrana interna (IM) sono mostrati, comprese le proteine transmembrana. Lo spazio periplasmatico, in cui si trova lo strato di peptidoglicano (PG), mostra proteine periplasmatiche solubili, proteine mal ripiegate e acidi nucleici. Il contenuto dell’OMV illustra parte delle biomolecole che sono state identificate sia sulla loro membrana che sul lume. (B e C) Micrografie elettroniche a trasmissione di cellule di Synechocystis sp. PCC 6803 colorate con acetato di uranile negativo che rilasciano una OMV (B, 120.000 × ingrandimento), e mezzo extracellulare concentrato senza cellule di Synechocystis sp. PCC 6803 che mostra diverse OMV (C, 40.000 × ingrandimento).
(A)Basato su Jan, A.T., 2017. Vescicole di membrana esterna (OMVs) di batteri Gram-negativi: un aggiornamento prospettico. Front. Microbiol. 8, 1053.
Numerosi studi hanno dimostrato che le OMVs sono arricchite in componenti OM, ovvero LPS e OMPs, così come proteine periplasmatiche, frammenti PG, e persino acidi citoplasmatici e nucleici (Biller et al., 2014, 2017; Lee et al., 2016). I primi rapporti non hanno effettivamente differenziato le MV formate artificialmente in soluzione (a causa del comportamento lipidico naturale di raggruppamento in vescicole, intrappolando indiscriminatamente materiale dalla lisi batterica) dalle OMV intatte. Più recentemente, metodologie di isolamento migliorate e tecniche omiche all’avanguardia hanno permesso un’attenta analisi della composizione delle OMV. È interessante notare che le OMV sono in effetti arricchite in specifici componenti cellulari, mentre sono impoverite in altri (Lee et al., 2008), sostenendo l’idea che la selezione del contenuto del carico non è un processo casuale. Ad esempio, il contenuto delle OMVs di Salmonella sp. variava in base alle condizioni di crescita testate: nelle OMVs isolate da cellule in condizioni di abbondanza di nutrienti, venivano rilevate preferenzialmente proteine citosoliche coinvolte nella traduzione e nel metabolismo cellulare, mentre in condizioni nutrizionali limitanti le OMVs erano arricchite in proteine di membrana coinvolte nel trasporto dei nutrienti (Bai et al., 2014). Inoltre, un approccio basato sulla spettrometria di massa ha indicato che nessun componente specifico ampiamente conservato è stato rilevato in OMVs (Schwechheimer et al., 2013), ancora una volta indicando verso una composizione variabile. Tutto sommato, ci si aspetta che le composizioni differenziali di OMVs siano sia legate a particolarità dell’involucro cellulare dipendenti dal ceppo che a nicchie ecologiche distinte (Yoon, 2016).
Sono stati proposti tre meccanismi di formazione di OMVs non mutualmente esclusivi. In un modello, la vescicolazione si verifica quando i legami incrociati covalenti tra le proteine di membrana e lo strato di PG sono localmente rotti, sia da una diminuzione temporanea dell’abbondanza complessiva dei legami incrociati o da uno spostamento localizzato dei legami incrociati, promuovendo il rigonfiamento di piccole porzioni di OM. Un altro modello coinvolge nanoterritori periplasmatici in cui si accumulano proteine mal ripiegate e altri componenti dell’involucro (LPS o frammenti di PG). In seguito a questo accumulo anormale e confinato di componenti cellulari, l’integrità dell’involucro diminuisce localmente, innescando il blebbing di porzioni di OM cariche di contenuto lumenale. Infine, è stato anche proposto che particolari caratteristiche biofisiche di alcuni lipidi OM possano promuovere la vescicolazione, individuando l’integrazione specifica di LPS o fosfolipidi, portando ad alterazioni della fluidità e della flessibilità della membrana. Si presume inoltre che molti altri fattori influenzino la dimensione, il tasso di produzione e la composizione delle OMV, e se esiste un processo di biogenesi delle OMV consensuale, esso non è interamente caratterizzato (Kulp e Kuehn, 2010; Schwechheimer e Kuehn, 2015; Yoon, 2016).
Nella ricerca cianobatterica, il campo delle OMV è ancora piuttosto recente, e molto resta da esplorare. Questo è particolarmente ben illustrato dal fatto che la prima pubblicazione dedicata esclusivamente allo studio delle OMVs cianobatteriche risale al 2014 (Biller et al., 2014). In questo studio innovativo, non solo si dimostra che le colture controllate in laboratorio del cianobatterio marino Prochlorococcus rilasciano continuamente OMVs, ma anche che queste vescicole possono essere trovate abbondantemente in campioni di acqua di mare. Inoltre, è stato dimostrato che le OMV di Prochlorococcus sono in grado di sostenere la crescita di colture batteriche eterotrofe, implicando queste strutture nei flussi di carbonio marino. Inoltre, sono state osservate interazioni fago-vescicole marine, mostrando il potenziale delle OMV di agire come agenti “esca”. Nel complesso, gli autori hanno illustrato alcuni dei ruoli fondamentali delle OMV e le loro innumerevoli implicazioni per gli ecosistemi microbici (Biller et al., 2014). In una pubblicazione più recente, le OMVs di Prochlorococcus sono state confrontate con quelle di altri tre eterotrofi marini, nel tentativo di svelare la frequenza del confezionamento del DNA nelle vescicole e la variazione tra i diversi taxa (Biller et al., 2017). Esaminando la quantità e la distribuzione del DNA associato alle OMV, è stato dimostrato che il DNA è incapsulato in modo diverso all’interno e tra le popolazioni di OMV. Più decisamente, questo lavoro suggerisce che il meccanismo che impacchetta il DNA nelle OMVs non opera allo stesso modo in tutti i batteri (Biller et al., 2017). Oltre a Prochlorococcus e ai ceppi marini di Synechococcus, anche altri cianobatteri hanno dimostrato di formare e rilasciare OMVs, tra cui il Synechococcus sp. unicellulare PCC 7002 (Xu et al., 2013) e Synechocystis sp. PCC 6803 (Pardo et al., 2015; Oliveira et al., 2016), la filamentosa Jaaginema litorale LEGE 07176 (Brito et al, 2017), e le filamentose ed eterocistiche Anabaena sp. PCC 7120 (Oliveira et al., 2015a) e Cylindrospermopsis raciborskii (CYRF-01) (Zarantonello et al., 2018).
Oltre ai ruoli sopra descritti per le OMV derivate dai cianobatteri marini (Biller et al., 2014), sono state proposte altre funzioni per queste vescicole extracellulari. Il rilascio di OMVs da parte dei cianobatteri potrebbe funzionare come una via di secrezione efficace. Un ceppo di Synechococcus sp. PCC 7002, ingegnerizzato metabolicamente e privo di due geni di glicogeno sintasi, glgA-I e glgA-II, ha dimostrato di rilasciare significativamente più OMV rispetto al ceppo wild-type (Xu et al., 2013). Gli autori hanno ipotizzato che, poiché questo mutante è stato osservato esportare spontaneamente zuccheri solubili nel mezzo, gli OMV osservati potrebbero essere legati a questo meccanismo di secrezione, anche se il contenuto di zucchero degli OMV osservati non è stato valutato (Xu et al., 2013). Inoltre, un ceppo Synechocystis sp. PCC 6803 privo dell’omologo TolC (essenziale per i meccanismi di secrezione dipendenti dalla membrana; vedi Figg. 1 e 3) ha anche dimostrato di rilasciare significativamente più OMV rispetto al ceppo parentale (Oliveira et al., 2016). Poiché il tolC-knockout era fortemente compromesso nella secrezione di proteine intracellulari, metaboliti e composti esogeni, è stato proposto che l’ipervescicolazione potrebbe soddisfare la necessità di secrezione. In accordo, le OMV cianobatteriche sono state anche suggerite per trasportare il materiale necessario per lo sviluppo del biofilm. Questo è stato proposto dopo l’osservazione di vescicole derivate dai cianobionti nello sporocarpo della felce acquatica Azolla microphylla (Zheng et al., 2009). Inoltre, poiché il materiale genetico è stato osservato all’interno di queste vescicole, esse potrebbero essere vettori per il trasferimento genico laterale tra il cianobionte e la felce (Zheng et al., 2009). Tuttavia, le OMV cianobatteriche possono anche funzionare come un meccanismo per dissipare lo stress dell’involucro: Gonçalves et al. hanno caratterizzato un insieme di ceppi di Synechocystis sp. PCC 6803 privi di diversi componenti della translocasi IM coinvolti nei sistemi di secrezione TolC-dipendenti (Gonçalves et al., 2018). È interessante notare che tra i vari ceppi che presentavano diverse capacità di rilascio di OMV, il tolC-knockout (il più alto produttore di OMV nello studio) era l’unico che mostrava livelli di trascrizione notevolmente elevati di spy e degQ, codificanti proteine coinvolte nelle risposte allo stress dell’involucro, e la sovraespressione di spy e DegP (Gonçalves et al., 2018). Così, gli autori hanno suggerito che la delezione di tolC elicita lo stress dell’involucro, e che l’ipervescicolazione nel tolC-knockout rappresenta un meccanismo indipendente per affrontare tali condizioni di stress (Gonçalves et al., 2018).