La malattia di Albers-Schönberg (osteopetrosi autosomica dominante, tipo II) risulta da mutazioni nel gene del canale del cloruro ClCN7

Abstract

La malattia di Albers-Schönberg, o osteopetrosi autosomica dominante, tipo II (ADO II), è la forma più comune di osteopetrosi, un gruppo di condizioni caratterizzate da un aumento della massa scheletrica a causa di un alterato riassorbimento di ossa e cartilagini. A seguito dell’assegnazione del gene che causa ADO II al cromosoma 16p13.3, ora riportiamo sette diverse mutazioni nel gene che codifica il canale del cloruro ClCN7 in tutte le 12 famiglie ADO II analizzate. Inoltre, un paziente con la grave, autosomica recessiva, forma infantile di osteopetrosi (ARO) è stato identificato come omozigote per una mutazione ClCN7. Dalle correlazioni genotipo-fenotipo, sembra che ADO II rifletta un effetto negativo dominante, mentre le mutazioni di perdita di funzione in ClCN7 non causano anomalie in individui eterozigoti. Poiché alcuni pazienti ARO hanno mutazioni in entrambe le copie del gene ClCN7, ADO II è allelico con un sottogruppo di casi ARO.

Ricevuto il 2 ottobre 2001; rivisto e accettato l’11 ottobre 2001.

INTRODUZIONE

In salute, il rimodellamento del tessuto osseo risulta dai processi equilibrati di formazione e riassorbimento dell’osso. Un riassorbimento eccessivo causa l’osteoporosi, che è responsabile della maggior parte delle fratture non traumatiche (1). Al contrario, un riassorbimento osseo difettoso causa l’osteopetrosi caratterizzata da ossa dense ma solitamente fragili. Almeno otto tipi di osteopetrosi sono stati descritti nell’uomo (2). Il deficit dell’isoenzima dell’anidrasi carbonica II causa un’osteopetrosi autosomica recessiva (ARO) con acidosi tubulare renale e calcificazioni cerebrali (3; MIM 259730), mentre la maggioranza dei casi di ARO maligna (4; MIM 259700) riflette mutazioni nel gene TCIRG1 (5,6). Alcuni rari casi di osteopetrosi, apparentemente con una modalità di eredità autosomica recessiva, presentano un fenotipo più lieve e sono quindi chiamati forma “intermedia” (7,8; MIM 259710).

L’osteopetrosi autosomica dominante (ADO) è molto più comune delle sue controparti recessive (9). Tuttavia, a causa del suo quadro clinico relativamente benigno, con molti pazienti che sono asintomatici e solo rilevato da un esame radiografico coincidente, la prevalenza di ADO è sottostimata. Tra le famiglie con ADO, sono generalmente riportati due sottotipi basati principalmente sulle caratteristiche radiografiche (10,11). Il tipo I (ADOI) presenta un’osteosclerosi generalizzata e diffusa che colpisce soprattutto la volta cranica (11). Il tipo II (ADO II; MIM 166600), la forma originariamente descritta nel 1904 da Albers-Schönberg (12), è la forma più comune con una prevalenza stimata fino a 5,5/100 000 (13). Le manifestazioni cliniche includono fratture non traumatiche, specialmente delle ossa lunghe, paralisi dei nervi cranici, osteoartrite dell’anca e osteomielite mandibolare (14). ADO II si manifesta radiograficamente con un’osteosclerosi segmentaria, prevalentemente alle endplates vertebrali (‘rugger jersey spine’), ali iliache (segno ‘bone within bone’) e base cranica (9) (Fig. 1).

Recentemente, una ricerca genome-wide ci ha portato ad assegnare un gene sottostante ADO II al cromosoma 16p13.3 (15). È interessante notare che il gene che codifica il canale del cloruro ClCN7 risiede nella regione candidata di 8,4 cM (16). Infatti, il canale del cloruro è essenziale per l’acidificazione della lacuna di riassorbimento extracellulare necessaria per la degradazione mediata dagli osteoclasti del tessuto osseo (17), ed è mutato in un paziente con ARO (17). Pertanto, abbiamo considerato ClCN7 sia un gene candidato posizionale che funzionale per causare la malattia di Albers-Schönberg.

RESULTS

Analisi delle mutazioni nelle famiglie ADO II

Poiché la sequenza genomica che include il gene ClCN7 è disponibile nei database di sequenze (GenBank accession nos AL031600 e AL031705), l’analisi delle mutazioni degli esoni e dei confini introne-esone è possibile utilizzando il DNA genomico. Questo sforzo ha rivelato sette mutazioni distintive in ClCN7 (Fig. 2) in 12 famiglie ADO II non correlate (Tabella 1). Cinque mutazioni sono missenso, uno risulta in una delezione di un amminoacido e uno cancella due nucleotidi causando un frameshift che colpisce l’estremità C-terminale della proteina. Nessuna di queste mutazioni è stata trovata in 100 cromosomi di controllo.

Quattro mutazioni sono mutazioni ridondanti. La mutazione 2423delAG è stata identificata in una famiglia francese e in una famiglia americana. La mutazione G215R si è verificata in una famiglia francese, una danese e una americana. La mutazione P249L è stata trovata in una famiglia francese e in una tedesca. Infine, la mutazione R767W è stata identificata in una famiglia francese e in una americana (tabella 1). Le diverse origini geografiche delle famiglie studiate, così come l’analisi dei marcatori microsatellitari che fiancheggiano il gene ClCN7 (dati non mostrati), indicano che si tratta di mutazioni indipendenti, cioè non ereditate da un antenato comune.

Analisi delle mutazioni di un paziente ARO

L’analisi di linkage con marcatori del cromosoma 16p13.3 ha chiaramente mostrato omozigosi per tutti i marcatori in un paziente ARO nato da genitori consanguinei sani (dati non mostrati). Pertanto, l’analisi di mutazione di ClCN7 è stata eseguita dimostrando una mutazione omozigote missenso in posizione 766 (L766P) (Fig. 2). Entrambi i genitori sono eterozigoti per questa mutazione.

Posizione e conservazione degli aminoacidi mutati

La topologia transmembrana proposta per i canali del cloruro ClC suggerisce 10-12 domini transmembrana (18). I cinque aminoacidi coinvolti nelle mutazioni missenso ADO II, così come la mutazione implicata nel paziente ARO, sono tutti altamente conservati tra i diversi membri della famiglia del gene del canale del cloruro ClC (Fig. 3). Le mutazioni G215R e P249L sono mutazioni ricorrenti trovate nei pazienti di tre e due famiglie non imparentate, rispettivamente (Tabella 1). G215 è un residuo altamente conservato situato tra D2 e D3 (Fig. 4), una regione nota per influenzare le proprietà del poro dei canali (19), mentre P249 prende parte ad un elemento strutturale altamente conservato che forma una parte sostanziale del poro del canale ClC (20). R286 si trova nello spazio extracellulare, appena fuori dal dominio transmembrana D5. Questo amminoacido è conservato tra le diverse proteine ClC, ad eccezione di ClC1 e ClC2 che hanno una sequenza divergente in questa regione della proteina. Le due rimanenti mutazioni ADO II e la mutazione ARO si trovano nella parte citosolica, C-terminale della proteina e coinvolgono aminoacidi vicini. G765, L766 e R767 si trovano all’interno del tratto D13, che coincide con il secondo dominio CBS (cistationina-β-sintasi) descritto nella proteina CLCN7 (21). Tutte e tre le mutazioni si localizzano all’interno del filamento β2 del dominio CBS in cui sono state riportate mutazioni che causano malattie umane (22). La funzione precisa di questo dominio non è ancora chiara, ma è stato suggerito un ruolo nello smistamento delle proteine (21).

Infine, le due piccole delezioni coinvolgono aminoacidi della parte intracellulare C-terminale di ClCN7. L’aminoacido L688, eliminato in un paziente, si trova tra i due domini CBS, mentre la delezione di due nucleotidi a partire dalla posizione nucleotidica 2423 risulta, in due famiglie non correlate, in una proteina che differisce dalla ClCN7 wild-type solo negli ultimi 10 aminoacidi.

DISCUSSIONE

Le osteopatie nei mammiferi comprendono un gruppo eterogeneo di condizioni che comprende almeno otto diverse entità cliniche nell’uomo (2) e circa nove mutanti animali spontanei (23). Inoltre, modelli murini knockout per diversi geni causano fenotipi osteopetrosi, illustrando la diversità dei fattori coinvolti nella differenziazione e attivazione degli osteoclasti (23).

Recentemente, l’eterogeneità delle osteopetrosi umane è stata sottolineata dall’eterogeneità genetica anche all’interno del sottotipo ADO II (24,25). Questa rivelazione si è basata su uno studio di linkage che ha coinvolto una famiglia estesa danese, che ha assegnato il gene ADO II al cromosoma 1p21 (26). Tuttavia, questa assegnazione non è stata confermata in studi su altre famiglie ADO II. Infatti, nel nostro recente studio di linkage, comprendente sei famiglie ADO II, abbiamo localizzato il gene che causa la malattia sul cromosoma 16p13.3 e trovato nella stessa famiglia danese la cosegregazione tra ADO II e un aplotipo del cromosoma 16p13.3 (15). Pertanto, abbiamo ipotizzato che la prova di collegamento al cromosoma 1p21 in questa famiglia rifletteva la cosegregazione accidentale. In questo studio attuale, abbiamo confermato questa ipotesi identificando una mutazione che causa la malattia (G215R) nel gene ClCN7 in questa famiglia danese. Questo, e il fatto che le mutazioni in questo gene sono state trovate in tutte le 12 famiglie ADO II analizzate, suggerisce che ADO II è geneticamente omogeneo.

I nostri risultati illustrano anche che ADO II è allelico con un sottogruppo di pazienti con la grave, autosomica recessiva, forma infantile di osteopetrosi. In precedenza, un paziente ARO è stato descritto come un eterozigote composto per una mutazione nonsense (Q555X) e una mutazione missense (R762Q) nel gene ClCN7 (17). Ora troviamo una mutazione omozigote (L766P) in un altro paziente ARO.

La figura 5 illustra la nostra correlazione tra i diversi genotipi e fenotipi. Come dimostrato dal fenotipo del topo knockout ClC-7, la perdita completa della funzione del canale del cloruro ClC-7 causa una grave osteopetrosi come si è visto nei pazienti ARO. Poiché le mutazioni ClCN7 sono state caratterizzate solo in due pazienti ARO fino ad oggi, è impossibile sapere se eventuali differenze fenotipiche riflettono la natura delle loro mutazioni. Alcuni rari casi di osteopetrosi hanno una forma “intermedia”. In questi casi, viene proposta una modalità di ereditarietà autosomica recessiva, ma il fenotipo è più lieve rispetto all’ARO (7,8). Forse questi casi sono dovuti a combinazioni di due mutazioni in ClCN7 che riducono solo lievemente la capacità di conduttanza del Cl-.

Le mutazioni ADO II qui riportate sono principalmente mutazioni missenso che coinvolgono aminoacidi conservati (Figg. 3 e 4). Le due mutazioni rimanenti sono piccole delezioni che conservano anche l’anatomia principale del canale del cloruro, e quindi molto probabilmente risultano in effetti comparabili alle mutazioni missenso. Poiché i canali del cloruro sembrano essere organizzati come multimeri, probabilmente dimeri (27), queste mutazioni probabilmente compromettono la loro funzione a causa di effetti dominanti negativi. Con tali effetti, la maggior parte dei canali del cloruro non funzionerà, spiegando le anomalie fenotipiche.

In generale, i genitori dei pazienti ARO sono fenotipicamente normali. Supponiamo che questo rifletta il fatto che l’aploinsufficienza per questo gene molto probabilmente non causa complicazioni cliniche o risultati radiografici. In alternativa, in alcuni casi questo può essere dovuto alla ridotta penetranza di ADO II. I genitori del paziente ARO presentato in questo studio non hanno sintomi clinici di ADO II, ma un’indagine radiografica non era disponibile.

La natura allelica di ADO II e ARO è supportata in un rapporto di una famiglia estesa che segrega ADO II in cui un individuo ha manifestato ARO (28). Forse in questa famiglia un gene ClCN7 mutato con un effetto dominante negativo causa ADO II che poi coincide con una mutazione de novo, o una mutazione ereditata dal secondo genitore che causa ARO. La spiegazione proposta per entrambe le forme dominanti e recessive di osteopetrosi associate a mutazioni ClCN7 è parallela alle mutazioni nel gene ClC-1 che causa la miotonia. Le mutazioni che risultano nella perdita di ClC-1 causano la forma autosomica recessiva (tipo Becker) (29) mentre le mutazioni missenso si manifestano con la forma meno grave, autosomica dominante (tipo Thomsen) (30).

In conclusione, dimostriamo che la maggior parte, se non tutti, casi di ADO II sono causati da mutazioni nel gene ClCN7. Sulla base della natura delle mutazioni ClCN7, il fenotipo ADO II deriva probabilmente da un effetto negativo dominante. I nostri risultati supportano l’ipotesi che i canali del cloruro generalmente agiscono come omomultimeri. Inoltre, il nostro studio illustra la natura allelica di ADO II e un sottoinsieme di casi ARO.

MATERIALI E METODI

Famiglie e pazienti

Le famiglie A-F sono state precedentemente descritte in quanto sono state utilizzate per localizzare il gene della malattia di Albers-Schönberg sul cromosoma 16p13.3 (15). I campioni G-L provengono da individui affetti da famiglie con una storia di malattia di Albers-Schönberg e diversi sono stati anche descritti (31-33) (Tabella 1).

La famiglia M vive negli Stati Uniti ma è di origine cinese. Il proposita è il figlio di una coppia sana ed è nato dopo una gestazione a termine. I genitori sono cugini di secondo grado. ARO è stata diagnosticata all’età di 3 mesi quando si è presentata al New York Hospital Medical Center del Queens con la paralisi di Bell. L’indagine scheletrica radiografica ha rivelato una grave osteopetrosi e diverse fratture oblique non dislocate. Aveva anemia, reticolocitosi, epatosplenomegalia e lieve atrofia del nervo ottico. La bambina fu sottoposta a un trapianto di midollo allogenico non compatibile, ma morì all’età di 18 mesi per sepsi e insufficienza respiratoria.

Analisi delle mutazioni

Il DNA fu isolato dal sangue con procedure standard. I primer degli introni (Tabella 2), che amplificano tutti gli esoni codificanti e i confini introne-esone di ClCN7, sono stati progettati da sequenze genomiche (GenBank accession nos AL031600 e AL031705). I 25 esoni sono stati amplificati da DNA genomico Taq-polimerasi o con sistema PCR enhancer (Gibco BRL), con concentrazione enhancer 1×. Per tutte le amplificazioni, sono stati eseguiti 30 cicli alla temperatura specificata nella tabella 2.

I prodotti di PCR sono stati purificati con il sistema di purificazione Concert Rapid PCR (Life Technologies) e sequenziati direttamente con i primer utilizzati per l’amplificazione, utilizzando la chimica Big-Dye terminator (Perkin-Elmer) su un sequenziatore automatico ABI 3100. L’amplificazione dell’esone 9 ha prodotto un frammento di lunghezza variabile perché questo esone segue una ripetizione in tandem di una sequenza di 50 bp con numero di copie variabile. Nel nostro set di campioni il numero di copie variava tra quattro e sette ripetizioni. Questa ripetizione interferisce anche in alcuni campioni con il sequenziamento di questo esone in direzione avanti.

Tutti gli esoni in cui sono state rilevate mutazioni putative, sono stati sequenziati in 100 cromosomi di controllo senza trovare le mutazioni.

RICONOSCIMENTI

Ringraziamo i pazienti e le famiglie così come i medici che hanno fornito materiale. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione (G.0404.00) dal ‘Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek’ (FWO) a W.V.H. Questa ricerca è stata anche sostenuta da sovvenzioni della ‘Société Française de Rhumatologie’ (SFR), il ‘Fonds d’Etude et de Recherche du Corps Médical des Hôpitaux de Paris’ (FERCMHP) e Shriners Hospital for Children (no. 8540).