La funzione delle proteine chaperone nell’assemblaggio dei complessi proteici coinvolti nei processi di adesione e fusione dei gameti

Complessi multiproteici nella capacitazione degli spermatozoi e nell’interazione ZP

Una volta raggiunto il sito di fecondazione, l’ampolla, gli spermatozoi devono penetrare due barriere prima di fondersi con la membrana plasmatica dell’ovulo, o oolemma. La prima di queste è uno strato ricco di acido ialuronico di cellule del cumulo che circondano l’ovocita e la seconda è la matrice extracellulare dell’ovocita stesso, la ZP (Hartmann et al. 1972). Nonostante lo sviluppo di entrambi i siti di legame della ZP e dell’acido ialuronico durante la spermatogenesi e l’acquisizione del potenziale di legame quando gli spermatozoi transitano nell’epididimo, queste cellule richiedono un periodo distinto di residenza nel tratto riproduttivo femminile prima di essere in grado di partecipare con successo a tali interazioni (Austin 1951, Chang 1951). I cambiamenti collettivi che gli spermatozoi subiscono in questo ambiente, chiamati capacitazione, permettono alle cellule di rispondere ai segnali provenienti dal complesso cumulo-ovocita e di completare un processo di esocitosi acrosomale, rendendoli competenti per la fusione con l’oolemma.

Lo ZP è composto da una serie di solfoglicoproteine, vale a dire ZP1, ZP2 e ZP3, che sono altamente conservate nella maggior parte delle specie di mammiferi (anche se un ulteriore ligando, ZP4/B, è stato riportato in ovociti umani e suini) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Si ritiene generalmente che questi ligandi governino il legame dello sperma nella maggior parte delle specie (vedi anche Reid et al. (2011)). Tuttavia, sono ancora allo studio diversi modelli sull’identità del recettore primario dello sperma all’interno della ZP e sui meccanismi con cui gli spermatozoi aderiscono a questa matrice (vedi anche Visconti & Florman (2010)). Allo stesso modo, le indagini sull’identità del recettore o dei recettori di superficie degli spermatozoi corrispondenti che riconoscono il ligando o i ligandi appropriati sulla ZP non sono riuscite a fornire risposte definitive. Infatti, c’è una crescente letteratura di knockout murini di proteine recettoriali candidate di buon auspicio (tra cui la β-1,4-galattosiltransferasi (GALT1), l’arilsolfatasi A (ARSA) e la molecola di adesione spermatica 1 (SPAM1); per una lista completa, vedi Ikawa et al. (2010)) che non portano a una completa infertilità (Hess et al. 1996, Asano et al. 1997, Baba et al. 2002). Piuttosto, vengono esibiti vari gradi di ridotta capacità di legame, sollevando la possibilità che questo processo comprenda un grado di ridondanza funzionale e che un certo numero di proteine spermatiche agiscano di concerto per mediare l’adesione ZP. Il coordinamento dell’attività di queste proteine per assicurare interazioni produttive con lo ZP sta quindi emergendo come un importante obiettivo di ricerca.

Nella maggior parte dei mammiferi euteri, si pensa che la capacitazione dello sperma sia iniziata dall’attivazione di un percorso mediato da cAMP che culmina nella fosforilazione della tirosina di più proteine spermatiche (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). I chaperoni molecolari sono in primo piano tra questa serie di proteine, con HSP90AA1, HSP90B1 e HSPD1 tra le proteine che mostrano la fosforilazione della tirosina come conseguenza della capacitazione (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004). I modelli attuali suggeriscono che la fosforilazione di questi chaperon durante la capacitazione innesca il loro ruolo attivo nell’assemblaggio delle proteine di riconoscimento ZP in complessi e/o la traslocazione di questi complessi alla superficie degli spermatozoi in preparazione alla fecondazione (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Oltre a questo ruolo indiretto nell’adesione dei gameti, i chaperoni di superficie degli spermatozoi hanno anche funzioni presunte come molecole di adesione che mediano il riconoscimento dei sulfoglicolipidi durante il legame dei gameti (Boulanger et al. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

Di recente, la tecnica della blue native PAGE (BN-PAGE), originariamente sviluppata per l’analisi dei complessi multienzimatici della catena di trasporto degli elettroni (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), è stata adattata per la valutazione dei complessi multimerici della superficie dello sperma nei topi e nell’uomo (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Questa tecnica permette la risoluzione elettroforetica di complessi proteici nativi che mantengono la loro attività biologica. Negli spermatozoi umani e di topo, l’uso del BN-PAGE in parallelo con il blotting Far-Western con intere zone solubilizzate ha rivelato diversi complessi multiproteici primari che possiedono affinità per ZP omologhi (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011).

È stato riportato che uno di questi complessi comprende i componenti proteici del complesso CCT/TRiC (CCT1-CCT8), una struttura a doppio anello che funziona come un chaperon molecolare con un ruolo chiave nella regolazione della formazione di complessi multiproteici (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). Prove putative sotto forma di saggi di co-immunoprecipitazione, co-localizzazione e legatura di prossimità hanno identificato la proteina legante ZP 2 (ZPBP2) come una delle proteine client più convincenti per il complesso CCT/TRiC negli spermatozoi maturi (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Originariamente implicato nel legame secondario di ZP, uno studio più recente ha dimostrato che i topi maschi nulli per ZPBP2 sono subfertili e mostrano difetti nell’interazione e nella penetrazione di ZP (Lin et al. 2007). Nei topi, c’è un’ulteriore prova che alcune subunità del complesso CCT/TRiC sono traslocate sulla superficie dello sperma durante la capacitazione dello sperma (Dun et al. 2011).

Un’altra importante classe di chaperon che è stata identificata sulla superficie dello sperma e implicata nella regolazione delle interazioni ZP è la famiglia HSP70 (Naaby-Hansen et al. 2010). Come per il complesso CCT/TRiC, i chaperoni della famiglia HSP70 hanno anche ruoli ben documentati nella facilitazione del trasporto di proteine transmembrana e nell’assemblaggio di complessi proteici stabili (Mayer & Bukau 2005). Un membro della famiglia HSP70 che mostra un’espressione esclusiva (topo) o predominante (uomo) nei testicoli sembra essere essenziale per la fertilità maschile. Infatti, l’espressione aberrante di questo chaperone, HSPA2, è stato correlato con un fenotipo di grave infertilità maschile negli esseri umani, che colpisce in particolare la capacità degli spermatozoi di interagire con ovociti omologhi in vitro (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Sia nel topo che nell’uomo, HSPA2 ha un ruolo fondamentale nella spermatogenesi, con una delezione mirata della proteina nella prima specie che porta ad un arresto precoce di questo processo e una concomitante assenza di spermatozoi (Eddy 1999). Negli esseri umani, i livelli di espressione di HSPA2 sono stati correlati positivamente con il successo della fecondazione in vitro (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003) e quindi sono presumibilmente in grado di predire lo stato di fertilità degli uomini con un alto grado di precisione (Ergur et al. 2002).

La caratterizzazione di HSPA2 nel nostro laboratorio ha rivelato che questo chaperone è presente nel dominio acrosomiale degli spermatozoi umani ed è un componente di almeno cinque complessi proteici ad alta massa molecolare (Redgrove et al. 2012), compreso un sottoinsieme di quelli mostrati in precedenza per possedere affinità ZP (Redgrove et al. 2011). Coerentemente con questi dati, abbiamo assicurato la prova che il più dominante dei complessi HSPA2 contiene due proteine aggiuntive, entrambi i quali sono stati precedentemente implicati nelle interazioni sperma-zona (Redgrove et al. 2012). Inoltre, in accordo con i risultati pubblicati da Huszar et al., siamo stati in grado di dimostrare una significativa riduzione dei livelli di HSPA2 negli spermatozoi di uomini con lesioni isolate nella loro capacità di impegnarsi in interazioni con ZP di ovociti omologhi in vitro (Redgrove et al. 2012). Il nostro lavoro attuale si sta concentrando sul fatto che il deficit nell’adesione ZP derivi da una formazione aberrante di siti di legame ZP nelle prime fasi della spermiogenesi (Huszar et al. 2000) o possa essere il risultato dell’incapacità di HSPA2 di partecipare agli eventi di rimodellamento della superficie dello sperma durante la capacitazione, come facilitare l’assemblaggio e/o la presentazione dei recettori ZP sulla superficie dello sperma in preparazione per l’interazione ZP.

Oltre al nostro lavoro sull’assemblaggio dei complessi di superficie dello sperma, Han et al. hanno indipendentemente identificato un complesso multiproteico alternativo carico di chaperoni sulla superficie degli spermatozoi di topo. È interessante notare che, come documentato sopra, questo complesso, che comprende HSPA5, calnexin, proteina integrale di membrana 2B e ADAM7, è apparentemente assemblato durante la capacitazione (Han et al. 2011). Mentre la funzione di questo complesso deve ancora essere completamente chiarita, l’espressione di ADAM7 è stata collegata alla presenza di altre proteine ADAM, ADAM2 e ADAM3 (Kim et al. 2006), che sono importanti per l’adesione degli spermatozoi allo ZP (Muro & Okabe 2011). Inoltre, è noto che HSPA5 è coinvolto nel promuovere l’adesione degli spermatozoi di alta qualità alle cellule epiteliali oviduttali (OEC) nell’istmo del tratto riproduttivo femminile. Si ritiene che la formazione di questo serbatoio abbia effetti pro-sopravvivenza in termini di mantenimento degli spermatozoi in uno stato di quiescenza non condensato, in preparazione del rilascio dell’ovocita nell’ampolla (Topfer-Petersen et al. 2002). È interessante notare che i chaperon HSPD1 e HSPA5 sono stati localizzati anche sulla superficie degli OEC bovini e sono stati quindi implicati nel legame sperma-OEC (Boilard et al. 2004).

Anche in linea con il nostro lavoro, il complesso identificato da Han et al. ha dimostrato di risiedere in microdomini di membrana o rafts lipidici, regioni specializzate della membrana che forniscono una piattaforma per l’assemblaggio funzionale e la presentazione di complessi multiproteici (Stein et al. 2006, Nixon et al. 2009, Han et al. 2011). Il partizionamento dei complessi chaperon nell’ambiente raft è stato osservato anche per HSPA2 negli spermatozoi umani (Nixon et al. 2011) e per i componenti del complesso CCT/TRiC negli spermatozoi di topo (Dun et al. 2011). Questi domini di membrana comprendono anche un certo numero di ulteriori proteine recettore putativo ZP, tra cui GALT1, ZP3R, e SPAM1, rafforzando il loro ruolo nel rimodellamento della superficie dello sperma e nel legame ZP (Fig. 1; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Il meccanismo (o i meccanismi) con cui tali proteine vengono reclutate nelle zattere lipidiche non sono ancora stati risolti; tuttavia, HSPA2 è stato segnalato per legarsi attraverso il suo dominio ATPasi al 3′sulfogalattosilglicerolipide, la principale glicoproteina identificata all’interno delle zattere lipidiche dello sperma (Mamelak & Lingwood 2001).

Oltre al ruolo putativo delle zattere lipidiche nel riposizionamento dei complessi chaperon chiave e delle proteine recettoriali ZP, ci sono anche prove convincenti che molti recettori putativi ZP, come ARSA e ZP3R, così come diversi chaperoni molecolari mostrano un riposizionamento dipendente dalla capacitazione da siti intracellulari come l’acrosoma alla superficie dello sperma per preparare le cellule prima delle loro interazioni con lo ZP (Nixon et al. 2009). È stato proposto che l’intimo contatto tra la membrana acrosomiale esterna e la membrana plasmatica dello spermatozoo sia mediato attraverso il legame di proteine complementari solubili N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE), portando alla formazione di pori di fusione che forniscono un percorso per la migrazione degli enzimi alla superficie spermatica prima della completa perdita del contenuto acrosomiale (Søgaard et al. 1994, Blas et al. 2005, Tsai et al. 2007). A sostegno di questo modello, uno studio di Brahmaraju et al. (2004) ha dimostrato che la somministrazione di anticorpi contro VAMP e SNAP nella vescicola acrosomale ha inibito il legame spermatozoo-ZP nel topo.

Questo progressivo adescamento della superficie spermatica ha sollevato domande sulla natura del tutto o niente dell’esocitosi acrosomale. Tuttavia, l’assemblaggio funzionale dei complessi SNARE sembra anche essere alla base dei prolungati eventi di fusione della membrana spermatica che permettono una perdita completa del contenuto acrosomale (Tsai et al. 2010). Sebbene sia opinione diffusa che il contatto con lo ZP dia inizio a questa esocitosi acrosomale nella maggior parte delle specie di mammiferi, una serie di studi effettuati nel topo hanno dimostrato che gli spermatozoi che iniziano l’esocitosi acrosomale prima del contatto con lo ZP sono ancora in grado di fecondare l’ovocita (Nakanishi et al. 1999, Jin et al. 2011). Questo fenomeno può essere vero anche per gli spermatozoi di cavia (Huang et al. 1981) e di criceto (Yanagimachi & Phillips 1984). Tali risultati suggeriscono un ruolo importante per l’ooforo del cumulo nell’inizio della reazione acrosomica e sollevano preoccupazioni circa la capacità degli studi in vitro effettuati con strutture della zona dell’ovocita denudate dal cumulo di riferire accuratamente sulla vera natura della reazione acrosomica e sull’interazione ZP.

Nonostante questa controversia, molecole simili a chaperoni sono state anche implicate nell’esocitosi acrosomiale in virtù della loro capacità di promuovere l’assemblaggio di SNARE contenenti glutamina (Q-SNARE) e arginina (T-SNARE) in complessi ternari stretti (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). È interessante notare che eleganti studi nei maiali hanno dimostrato che la capacitazione induce un aggancio stabile della membrana plasmatica dello sperma con la membrana acrosomale esterna in preparazione alla fecondazione (Tsai et al. 2010). Studi più recenti eseguiti da Tsai et al. (2012) hanno anche fornito la prova della presenza di vescicole miste unilamellari che, tra le altre importanti funzioni, permettono il reclutamento di proteine secondarie leganti ZP sulla superficie spermatica e possiedono un nuovo complesso SNARE trimerico composto da sintaxina 3, SNAP23, VAMP2, e un’ulteriore proteina, complexin 2. L’energia rilasciata dalla formazione di tali complessi viene a sua volta utilizzata per avviare la fusione della membrana, unendo la membrana plasmatica e la membrana acrosomale interna dello spermatozoo (Tomes et al. 2002). Il completamento di questo processo è critico nell’esposizione dei domini spermatici che partecipano agli eventi a valle della fecondazione: il legame dell’oolemma e la fusione.