Abstract
Il decotto Xiao-Yao-San (XYS) è una formula della medicina tradizionale cinese. Questo studio ha voluto indagare l’effetto di XYS sulle capacità cognitive e il suo meccanismo di base nei ratti ovariectomizzati. Le femmine di Sprague-Dawley sono state ovariectomizzate e trattate con XYS (3 g/kg o 9 g/kg) per via orale, con iniezione sottocutanea di 17-β estradiolo (E2, 2 μg/kg) come controllo farmacologico positivo e somministrazione di 1 ml di soluzione salina (0,9%) come controllo placebo. Dopo 6 settimane di trattamento, i ratti sono stati esaminati utilizzando il test Morris water maze. Il livello di estradiolo nel siero e nell’ippocampo è stato misurato tramite ELISA. La colorazione del Golgi è stata eseguita per osservare la morfologia neuronale nell’ippocampo. L’apoptosi delle cellule ippocampali è stata osservata mediante colorazione TUNEL. Il contenuto proteico del recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) 2A e 2B nella regione ippocampale CA1 è stato determinato mediante Western blot e immunoistochimica. L’espressione del recettore degli estrogeni (ER) e la segnalazione PI3K è stata rilevata da Western blot. Rispetto al gruppo sham, sia l’apprendimento e la memoria sono stati compromessi in ratti ovariectomizzati. I ratti trattati con E2 o XYS ad alte dosi hanno mostrato un apprendimento e una memoria migliori rispetto ai ratti trattati con soluzione salina. XYS ad alte dosi ha ridotto significativamente la latenza di fuga nella prova di acquisizione spaziale; nel frattempo, i tempi di attraversamento e la durata nel quadrante della sonda sono stati aumentati nella prova della sonda spaziale. XYS ad alta dose ha promosso la sintesi de novo del contenuto di E2 nell’ippocampo, ma non ha avuto alcun effetto significativo sul livello di E2 nel siero. La colorazione del Golgi ha indicato che XYS ad alta dose potrebbe aumentare il numero di rami e la densità delle spine dendritiche nell’area CA1 dell’ippocampo. La colorazione TUNEL ha mostrato che XYS ad alte dosi ha alleviato l’apoptosi neuronale indotta dall’ovariectomia. Il livello di espressione di NMDAR2A e NMDAR2B nell’ippocampo CA1 è stato aumentato dal trattamento XYS. L’effetto benefico di XYS era attraverso l’attivazione della segnalazione ERα-PI3K. In conclusione, il trattamento con XYS ad alte dosi può migliorare le capacità cognitive dei ratti ovariectomizzati proteggendo i neuroni dell’ippocampo e ripristinando il livello di E2 dell’ippocampo.
1. Introduzione
Le donne in perimenopausa soffrono spesso di ansia e depressione legate alla fluttuazione del livello di estrogeni. Oltre all’ansia e alla depressione, la dimenticanza è un’altra lamentela comune nelle donne in perimenopausa. Il Seattle Midlife Women’s Health Study ha riportato che il 60% delle donne di mezza età ha notato un deterioramento della memoria. Lo Study of Women’s Health Across the Nation (SWAN) ha scoperto che la perimenopausa era un fattore di rischio dipendente per la dimenticanza auto-riferita nelle donne di mezza età. Poiché il cervello è un obiettivo importante della regolazione degli estrogeni, si ipotizza che la carenza di estrogeni possa essere responsabile del deterioramento cognitivo. Tuttavia, i risultati degli studi osservazionali sull’influenza sulla cognizione non sono completamente coerenti. Inoltre, efficaci interventi terapeutici ormonali per migliorare le prestazioni cognitive devono ancora essere stabiliti. Inoltre, altri fattori, come lo stress percepito, l’umore e la salute fisica, possono anche contribuire ai sintomi della memoria. La produzione ovarica di estrogeni è più probabile che abbia un impatto sulla memoria in caso di brusca diminuzione piuttosto che di transizione naturale. Contrariamente all’incoerenza negli studi umani, i risultati negli animali ovariectomizzati supportano l’associazione della carenza di estrogeni con i cambiamenti cognitivi e l’efficienza della terapia ormonale sostitutiva.
La supplementazione con fitoestrogeni è una terapia alternativa popolare per alleviare i sintomi della menopausa. I fitoestrogeni, come i flavonoidi, gli isoflavoni e i lignani, hanno una struttura simile agli estrogeni steroidei e possono svolgere un ruolo simile agli estrogeni attivando i recettori degli estrogeni (ER). Una meta-analisi ha sostenuto l’efficacia dell’integrazione di isoflavoni di soia nel migliorare la memoria visiva in donne sane in postmenopausa. Lo SWAN Phytoestrogen Ancillary Study ha dimostrato che un’elevata assunzione di isoflavone o lignina potrebbe migliorare la velocità di elaborazione o la memoria verbale in una certa fase della menopausa, anche se il beneficio era anche legato all’etnia/alla razza. L’effetto dei fitoestrogeni sul miglioramento della cognizione è più chiaramente indicato negli studi sugli animali. Un estratto idroalcolico di semi di fieno greco potrebbe attenuare i danni ai neuroni dell’ippocampo indotti dall’ovariectomia (OVX) e migliorare le prestazioni di apprendimento e memoria in un modello di ratto.
Xiao-Yao-San (XYS), che significa polvere felice e spensierata in cinese, è una formula della medicina tradizionale cinese (MTC) che viene utilizzata per trattare l’ansia e la depressione della menopausa. La formula consiste di Bupleuri radix (Chaihu), Angelicae radix (Danggui), Paeoniae radix alba (Baishao), Atractylodis rhizome macrocephalae (Baizhu), Poria cocos (Fuling), Zingiberis siccatum rhizoma (Shengjiang), Menthae haplocalycis (Bohe), e Glycyrrhizae radix (Gancao). Un’analisi sistematica che include 26 studi randomizzati ha mostrato che XYS era superiore agli antidepressivi, indicato dai punteggi della scala di depressione Hamilton, e potrebbe migliorare l’efficacia degli antidepressivi nel migliorare i punteggi della scala di autovalutazione della depressione. Le donne in perimenopausa con esoftalmia e palpitazione potrebbero anche beneficiare del trattamento con XYS. Alcune azioni terapeutiche di XYS per alleviare la sindrome della menopausa possono essere attribuite alla presenza di fitoestrogeni. Diversi studi hanno riportato la presenza di fitoestrogeni in XYS. L’ergosterolo si trova in Poria cocos (Fuling) e il β-sitosterolo è noto per essere presente in Angelicae radix (Danggui). Miller-Marini et al. hanno sviluppato un saggio estrogeno-cimerico recettore/Gal4-response element regulated/luciferase-reporter per rilevare la presenza di fitoestrogeni in formule TCM complesse. Hanno analizzato Bupleurum & Peony Formula, una formula modificata di XYS con le stesse erbe principali e hanno trovato un contenuto misurabile di fitoestrogeni.
La presenza di fitoestrogeni in XYS suggerisce che XYS ha il potenziale per trattare il deterioramento cognitivo causato dalla carenza di estrogeni. Uno studio sugli animali ha dimostrato che XYS potrebbe attenuare lo stress da immobilizzazione cronica (CIS) indotto dall’apprendimento e dal deficit di memoria. Attualmente, nessuno studio ha valutato l’effetto di XYS sul miglioramento del deterioramento cognitivo nelle donne in perimenopausa. Pertanto, lo studio attuale ha indagato l’effetto di XYS sulle capacità cognitive e il suo meccanismo di base nei ratti OVX.
2. Materiali e metodi
2.1. Animali e trattamento
In totale, 60 ratti Sprague-Dawley femmina sono stati utilizzati in questo studio. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale per gli animali da esperimento (numero di approvazione: ACU170802). Gli animali sono stati alloggiati con libero accesso all’acqua e alla dieta standard in condizioni di temperatura e umidità controllate. I ratti sono stati divisi a caso in 5 gruppi (12 ratti/gruppo): gruppo sham, OVX + salina o gruppo O-saline, OVX + 17-β estradiolo (E2) o gruppo O-E2, OVX + XYS 9 g/kg o gruppo O-XYS9, e OVX + XYS 3 g/kg o gruppo O-XYS3. I ratti sono stati sottoposti a operazione OVX sotto anestesia come descritto preciously. Brevemente, un’incisione longitudinale è stata fatta in un terzo del tronco e 1-2 cm di distanza da ciascun lato della colonna vertebrale. Il tessuto adiposo è stato estratto delicatamente con delle pinzette. L’ovaio è stato identificato e le corna uterine sono state legate. L’ovaia è stata rimossa e l’incisione addominale è stata suturata. Nel gruppo sham, l’addome è stato inciso senza OVX.
Il trattamento è iniziato due settimane dopo l’operazione OVX ed è durato per sei settimane. I ratti nei gruppi di trattamento XYS hanno ricevuto XYS tramite ago gavage ad una singola dose giornaliera di 9 g/kg o 3 g/kg. L’iniezione sottocutanea di E2 (2 μg/kg) è stata impostata come controllo farmacologico positivo. L’ingestione di 1 ml di soluzione salina (0,9%) è stata impostata come controllo placebo. Il decotto XYS è stato usato sotto forma di estratto (1 g/ml, equivalente a 1 g di erbe grezze/ml), fornito dall’Ospedale Affiliato dell’Università di Medicina Tradizionale Cinese di Nanjing. La formula del decotto di XYS è stata riportata preziosamente. La dose di XYS usata nella clinica per le donne in perimenopausa è di 175 g di erbe grezze/60 kg, che è equivalente a 3,5 g/kg nei ratti. Facendo riferimento ad altri rapporti sperimentali sul modello di ratto, abbiamo fissato la dose bassa a 3 g/kg e la dose alta a 9 g/kg . E2 polvere (Cat. no. E2758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) è stato sciolto in una piccola quantità di etanolo, e poi 20 μg/ml soluzione di stoccaggio è stato preparato con 0,9% di soluzione salina.
2.2. Morris Water Maze Test
La funzione di apprendimento e memoria dei ratti è stata valutata utilizzando il test Morris water maze (MWM). Il dispositivo dell’esperimento MWM è una piscina rotonda (200 cm di diametro) con acqua alta 38-40 cm. La temperatura dell’acqua è mantenuta costante a 20-22°C. Il test WMW consiste di tre parti, vale a dire, la prova di acquisizione spaziale (della durata di 5 giorni), la prova di sonda spaziale, e la prova di piattaforma visibile. Nella prova di acquisizione spaziale, i ratti sono stati delicatamente collocati in un quadrante casuale del serbatoio dell’acqua con la piattaforma nascosta a 1,5 cm nel quadrante nord-est sotto l’acqua. Ogni ratto è stato autorizzato a nuotare per un massimo di 60 s per trovare la piattaforma. I ratti che non sono riusciti a trovare la piattaforma entro 60 s sono stati guidati ad essa e la latenza è stata registrata come 60 s. La latenza di fuga è stata registrata da un sistema di analisi video (ANY-maze Animal Behavior Analysis System, Stoelting Company, USA). I ratti sono stati addestrati 4 volte al giorno. Dopo 5 giorni di formazione, i ratti hanno ricevuto la prova sonda spaziale con la piattaforma rimossa dal quadrante nord-est. I ratti sono stati collocati nella stessa posizione di partenza nel quadrante nord-ovest. Sono state registrate le tracce di viaggio dei ratti alla ricerca della piattaforma in 120 s. La durata e i tempi di attraversamento nel quadrante di destinazione sono stati calcolati per valutare la ritenzione della memoria spaziale. Il giorno successivo alla prova della sonda spaziale, i ratti hanno ricevuto la prova della piattaforma visibile simile all’addestramento della piattaforma nascosta, in cui la piattaforma è stata sollevata di 1,5 cm sopra la superficie dell’acqua e posta nel quadrante sud-ovest. Ogni ratto è stato rilasciato 4 volte, e ogni volta da un punto di ingresso diverso. La latenza di fuga, la distanza di nuoto e la velocità di nuoto sono stati registrati.
2.3. Raccolta dei campioni
Dopo aver terminato il test MWM, i ratti sono stati toracotomizzati e intubati in aorta ascendente attraverso il ventricolo sinistro sotto anestesia con pentobarbital di sodio (40 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale). Il sangue del tronco è stato raccolto utilizzando un tubo separatore di siero per il rilevamento di E2. Ippocampi da sei ratti sono stati separati dalla corteccia cerebrale e tessuti cerebrali circostanti, rapidamente rimosso, lavato con PBS freddo, e congelato in azoto liquido per il rilevamento di E2 e Western blot. Tre tessuti cerebrali non infusi sono stati immobilizzati in paraformaldeide 4% per 24 h e utilizzati per la colorazione Golgi e immunoistochimica. I tre ratti di sinistra sono stati perfusi transcardialmente con soluzione fisiologica fredda, seguita dalla fissazione in paraformaldeide al 4% per 1 h. I cervelli sono stati poi rimossi, fissati in paraformaldeide al 4% per 24 h, e incorporati in paraffina per la colorazione TUNEL.
2.4. E2 Detection
I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare a temperatura ambiente e sono stati centrifugati per 15 minuti a 4°C per separare il siero. I tessuti dell’ippocampo sono stati pesati, omogeneizzati in soluzione fisiologica fredda e centrifugati per 20 minuti per raccogliere il surnatante. Il contenuto di E2 nel siero e nel surnatante dell’omogenato dell’ippocampo è stato rilevato dal kit ELISA (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Cina).
2.5. Colorazione Golgi
L’ippocampo è stato tagliato in piccoli blocchi e trattati per la colorazione Golgi come descritto. Brevemente, i blocchi di ippocampo sono stati immersi in soluzione di colorazione Golgi (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, Cina) per 14 giorni, durante i quali la soluzione colorante è stato sostituito ogni 2-3 giorni. I tessuti sono stati disidratati con saccarosio al 30% e sezionati a 100 μm. Sezioni sono stati trattati con disidratazione etanolo, chiarificato con xilene, e montato su vetrini rivestiti di gelatina. La colorazione del Golgi è stata eseguita con successo in tutti i campioni. La morfologia dei neuroni nell’ippocampo è stata osservata al microscopio ottico (Nikon, Tokyo, Giappone). I neuroni nella regione CA1 dell’ippocampo sono stati analizzati utilizzando il Neuron J inserito nel software Image J. Cinque sezioni sono state selezionate per ogni ratto, e le spine dendritiche con morfologia completa sono state selezionate per ogni sezione. La densità e i punti di diramazione delle spine dendritiche sono stati misurati.
2.6. Immunoistochimica
L’espressione delle subunità 2A e 2B del recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) nell’ippocampo è stata determinata mediante immunoistochimica secondo la procedura standard. Gli anticorpi primari utilizzati erano coniglio anti-NMDAR2A (1 : 200, Boster Biological Technology, Wuhan, Cina) e coniglio anti-NMDAR2B (1 : 400, Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Cina). L’anticorpo secondario era anti-coniglio IgG coniugato con HRP (Servicebio).
2.7. I cambiamenti morfologici nell’ippocampo sono stati rilevati mediante colorazione TUNEL con un kit commerciale (Roche, Mannheim, Germania) come da istruzioni. Le sezioni sono state sottoposte a reazione colorimetrica DAB seguita da colorazione con ematossilina. Il nucleo delle cellule apoptotiche TUNEL-positive era marrone al microscopio ottico. Cinque sezioni sono state selezionate per ogni ratto e tre campi non ripetitivi (ingrandimento 400x) sono stati selezionati per ogni sezione. La percentuale di cellule TUNEL-positive in tutte le cellule è stata calcolata.
2.8. Western Blot
La parte di cervello ippocampale CA1 è stata rapidamente estratta e tagliata in piccole sezioni secondo l’atlante del cervello. I tessuti dell’ippocampo sono stati incubati per una notte con il buffer di lisi RIPA (contenente 100 Mm PMSF, acquistato da Servicebio). I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione per 10 minuti per raccogliere il surnatante contenente proteine. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). I lisati proteici (30 μg/lane) sono stati separati mediante SDS-PAGE al 10% ed elettroblottati su membrana PVDF. Dopo essere stata bloccata con il 5% di latte non grasso, la membrana è stata sondata durante la notte con i seguenti anticorpi primari: coniglio anti-NMDAR2A (1 : 500, Millipore, Billerica, MA, USA), coniglio anti-NMDAR2B (1 : 2000, Millipore), coniglio anti-CYP19 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), coniglio anti-ERα (1 : 2000, Millipore), coniglio anti-phospho-ERα (Ser118, 1 : 2000, Millipore), coniglio anti-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 110β (1 : 1000, Millipore), coniglio anti-Bax (1 : 1000, Abcam), coniglio anti-Bcl-2 (1 : 1000, Abcam), e coniglio anti-GAPDH (1 : 1000, Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA). GAPDH è stato rilevato come controllo interno. Poi la membrana è stata sondata con IgG di capra anti-coniglio coniugate con perossidasi di rafano (HRP) secondaria (1 : 5000, Bioworld) per 1,5 ore. Le bande sono state visualizzate con il metodo della chemiluminescenza. La densità ottica media delle bande proteiche è stata quantificata dal software Image J.
2.9. Analisi statistica
I dati sperimentali sono stati analizzati dal software GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). I dati numerici sono stati espressi come media ± SD. La differenza tra due gruppi è stata confrontata con il t-test. I risultati della prova di piattaforma nascosta sono stati analizzati da gruppo × giorno misure ripetute ANOVA seguita da post hoc di Tukey. Altri confronti multipli sono stati analizzati da ANOVA a una via seguita dal post hoc di Tukey. il valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
3.1. La decozione Xiao-Yao-San migliora l’apprendimento spaziale e le capacità di memoria dei ratti ovariectomizzati
La capacità di apprendimento è stata prima valutata utilizzando la prova di acquisizione spaziale. L’ANOVA a misure ripetute ha mostrato che sia il trattamento che i giorni di allenamento hanno influenzato la latenza di fuga (Figura 1(a)). La latenza di fuga in tutti i gruppi è diminuita con l’aumento dei giorni di formazione (), e la differenza era anche significativa nella tendenza del declino della latenza all’interno di ogni gruppo (). Non c’era alcuna interazione tra il trattamento e i giorni di allenamento (). Durante i primi due giorni di allenamento, non è stata osservata alcuna differenza significativa nella latenza di fuga di ciascun gruppo. Dal terzo giorno di addestramento, la latenza di fuga era significativamente più lunga di quella del gruppo sham; la latenza di fuga del gruppo E2 e XYS9 ad alto dosaggio era più breve di quella del gruppo salino, ma non diversa da quella del gruppo sham. Dopo 5 giorni di allenamento, i ratti sono stati valutati con la prova della sonda per testare la memoria spaziale. Come mostrato nella Figura 1(b), i tempi di attraversamento, il tempo di durata e la percentuale del tempo di durata nel quadrante della sonda era significativamente ridotta nel gruppo salino. Nessuna differenza è stata osservata nel tempo di durata in altri quadranti. Il trattamento con XYS o E2 potrebbe ripristinare significativamente i tempi di attraversamento e la durata nel quadrante della sonda al livello del gruppo sham. Al fine di escludere gli effetti dei fattori ambientali e dei livelli cognitivi e di attività degli animali sperimentali sull’apprendimento spaziale e la memoria, i ratti sono stati sottoposti anche alla prova della piattaforma visibile (Figura 1 (c)). Non ci sono state differenze significative nella latenza di fuga, nella distanza di nuoto e nella velocità di nuoto tra i gruppi. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che l’apprendimento spaziale e la memoria erano compromessi nei ratti OVX, e il trattamento con XYS ad alte dosi potrebbe migliorare efficacemente le funzioni cognitive compromesse.
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3.2. Il decotto Xiao-Yao-San aumenta il contenuto di estrogeni dell’ippocampo nei ratti ovariectomizzati
In seguito, abbiamo studiato l’effetto di XYS sul livello di estrogeni nei ratti OVX. Come mostrato nella Figura 2(a), il trattamento con XYS non ha migliorato il livello di estradiolo nel siero ridotto a causa di OVX; tuttavia, non vi era alcuna differenza significativa nei livelli di estradiolo nel siero tra i gruppi di trattamento sham e OVX. Da notare che XYS ad alte dosi e E2 hanno aumentato il livello di estradiolo ippocampale rispetto alla soluzione salina (Figura 2(b)). O-XYS3 gruppo aveva ancora più bassi livelli di estradiolo ippocampale rispetto al gruppo sham. Il cambiamento del contenuto ippocampale E2 non può essere spiegato dal cambiamento gonade-derivato contenuto E2, ma dal cambiamento di sintesi in situ. Pertanto, abbiamo rilevato l’espressione di CYP19, l’enzima finale nella sintesi degli estrogeni, nell’ippocampo. I risultati hanno mostrato che il trattamento con XYS o E2 potrebbe aumentare l’espressione di CYP19 rispetto al gruppo salina (), ma solo la differenza tra il gruppo XYS ad alta dose e il gruppo salina era significativa (). Il trattamento non ha ripristinato il livello di CYP19 a quello del gruppo sham. I risultati suggeriscono che XYS ha promosso l’espressione dell’aromatasi nell’ippocampo, aumentando così la sintesi de novo di E2.
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3.3. Il decotto Xiao-Yao-San riduce il danno neuronale nell’ippocampo dei ratti ovariectomizzati
La morfologia cellulare nell’ippocampo, specialmente nella regione CA1, gioca un ruolo importante nella capacità cognitiva. La morfologia cellulare nell’ippocampo è stata analizzata dalla colorazione del Golgi, come mostrato nella Figura 3(a). Rispetto al gruppo sham, il numero di neuroni nel gruppo salina è diminuito significativamente, e la morfologia delle spine dendritiche è stata danneggiata. Ulteriori analisi dei neuroni CA1 hanno mostrato che il numero puntuale di neuroni e la densità delle spine dendritiche è diminuita significativamente nel gruppo salino (Figure 3(b) e 3(c)). Il trattamento con XYS ad alte dosi ha aumentato il numero di neuroni nell’ippocampo e ha aumentato il numero puntuale di neuroni e la densità delle spine nella regione CA1. Il trattamento con E2 ha avuto lo stesso effetto terapeutico di XYS ad alta dose. Tuttavia, XYS a bassa dose non ha migliorato efficacemente il danno neuronale nella regione CA1 dell’ippocampo. Coerentemente, l’apoptosi dei neuroni ippocampali (CA1, CA3, DG) è stata ridotta dal trattamento XYS o E2 ad alte dosi (Figura 4). Tuttavia, XYS a bassa dose potrebbe solo ridurre l’apoptosi dei neuroni CA3 ma non ha avuto alcun effetto sui neuroni CA1 e DG. Nel complesso, XYS ad alta dose potrebbe ridurre il danno neuronale nell’ippocampo, soprattutto nella regione CA1.
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Xiao-Yao-San decotto aumenta l’espressione ippocampale di NMDAR2A e NMDAR2B in ratti ovariectomizzati.
La plasticità sinaptica è la base neurobiologica per l’apprendimento e la memoria a lungo termine, e le prestazioni nel test MWM è influenzata dalla funzione NMDAR. Pertanto, abbiamo ulteriormente stimato l’espressione delle subunità NMDAR 2A e 2B nell’ippocampo CA1. Western blot (Figure 5(a) e 5(b)) ha mostrato che l’espressione di NMDAR2A e NMDAR2B era ridotta nei ratti OVX. Il trattamento con XYS o E2 ha aumentato significativamente il livello di espressione di queste due proteine allo stesso livello di quello nel gruppo sham. L’immunoistochimica (Figura 5(c)) ha anche mostrato che la proporzione di cellule colorate positivamente è aumentata nei gruppi di trattamento. Rispetto al gruppo salino, XYS ad alta dose ha aumentato significativamente l’espressione di entrambi NMDAR2A e NDMAR2B ( e 0,013, rispettivamente), ma XYS a bassa dose potrebbe solo aumentare significativamente l’espressione di NMDAR2A ().
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3.4. Il decotto Xiao-Yao-San attiva la via di segnalazione PI3K attraverso ERα
L’impatto di E2 o fitoestrogeni sulla fisiologia è mediato dalla segnalazione ER. Gli studi hanno dimostrato che l’attivazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK), una proteina chinasi attivata da mitogeno, è necessaria per gli effetti benefici di E2 sulla memoria. La fosforilazione di ERK1/2 dipende dall’attivazione di PI3K. Pertanto, abbiamo studiato l’effetto di XYS sulla segnalazione ER-PI3K. Come mostrato nella Figura 6, XYS ad alta dose e E2 hanno promosso significativamente l’espressione di ERα, ERα fosforilato (Ser118), e PI3K p110β (la subunità catalitica) rispetto al gruppo salino. L’attivazione di ERα-PI3K ha ridotto ulteriormente l’espressione del fattore proapoptotico Bax e ha aumentato l’espressione del fattore antiapoptotico Bcl-2. Tuttavia, XYS a basso dosaggio non ha influenzato significativamente la segnalazione ERα-PI3K, il che è coerente con i risultati delle figure 3 e 4.
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4. Discussione
XYS è stato a lungo usato per trattare l’ansia e la depressione in perimenopausa. Il nostro studio ha esplorato la nuova applicazione di XYS nel trattamento del deterioramento cognitivo indotto da OVX. I risultati hanno mostrato che XYS ha efficacemente migliorato l’apprendimento spaziale e la memoria spaziale nei ratti OVX. Il possibile meccanismo è che XYS promuove la sintesi de novo degli estrogeni nell’ippocampo, attivando così la via di segnalazione ERα-PI3K e inibendo l’apoptosi dei neuroni dell’ippocampo.
Il meccanismo sottostante di XYS per il trattamento della depressione è stato ampiamente studiato. XYS svolge un ruolo antidepressivo regolando una rete completa che coinvolge neurotrasmettitori, neurotrofine, asse ipotalamo-ipofisi-surrene, aminoacidi e lipidi. Alcuni di questi studi hanno dimostrato che XYS può agire sui cambiamenti cerebrali legati allo stress. I saggi in vitro hanno dimostrato che un siero contenente XYS potrebbe invertire il cambiamento del potenziale di membrana mitocondriale, la concentrazione di calcio libero e il tasso apoptotico dei neuroni indotti dallo stress ossidativo. Il nostro studio ha dimostrato che XYS ha anche attenuato l’apoptosi neuronale nella regione dell’ippocampo dei ratti OVX. Gli effetti antiapoptotici di XYS suggeriscono che ha il potenziale per agire su una varietà di processi patologici legati all’apoptosi neuronale del cervello.
I risultati del nostro studio hanno dimostrato che XYS potrebbe ripristinare il livello di estrogeni nell’ippocampo dei ratti OVX. L’ippocampo è essenziale per la formazione della memoria ed è ricco di ER, e gli estrogeni facilitano una maggiore salute cognitiva e sinaptica attraverso questi ER. Diversi studi clinici hanno indicato l’efficacia della terapia ormonale sostitutiva sui sintomi cognitivi legati alla perdita di estrogeni nelle donne. XYS potrebbe aumentare il livello di estradiolo nell’ippocampo, che dovrebbe essere la base fondamentale per la sua efficacia nel migliorare le capacità cognitive dei ratti OVX. Tuttavia, XYS non ha aumentato il livello di estradiolo nel siero. Questo può essere dovuto al fatto che l’estradiolo può essere sintetizzato de novo nell’ippocampo, mentre l’estradiolo sierico proviene dalle gonadi. I nostri risultati hanno mostrato che XYS ha aumentato l’espressione di CYP19 nell’ippocampo, suggerendo che l’aumento di E2 nel cervello era probabilmente derivato dall’ippocampo. I risultati del nostro studio hanno mostrato che XYS ha aumentato l’espressione di NMDAR2A e NMDAR2B nell’ippocampo dei ratti OVX. Questo risultato è stato coerente con gli studi precedenti. Gli estrogeni sono stati trovati per aumentare sia la densità delle spine dendritiche che il numero di sinapsi nell’ippocampo attraverso la modulazione delle funzioni NMDAR nei ratti OVX. L’estrogeno potrebbe anche ripristinare la morfologia dei neuroni dell’ippocampo nei ratti anziani, ripristinando il livello di NMDAR2B a quello visto nel livello giovane nella regione CA1; inoltre, gli estrogeni possono influenzare la mobilità di NMDAR2A e NMDAR2B attraverso la sinapsi. L’attivazione di NMDAR a sua volta potrebbe contribuire alla sintesi di E2 ippocampale inducendo l’afflusso di Ca2 +.
Oltre a NMDARs, XYS può regolare l’espressione di altri fattori legati alla cognizione nel cervello. La perdita della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95), della sinaptofisina e del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) nell’ippocampo è stata direttamente correlata a deficit di apprendimento e memoria. L’effetto di XYS nei ratti CIS è stato correlato alla promozione dell’espressione di PSD-95 e sinaptofisina nell’ippocampo. XYS ha anche dimostrato di upregolare BDNF nella corteccia frontale, nella regione ippocampale CA1 e nell’amigdala dei ratti CIS. Durante il processo di trattamento CIS di XYS, la via di segnalazione c-Jun N-terminal kinase (JNK) è stata inibita nell’ippocampo .
Anche se non abbiamo esplorato specificamente quale componente è il principale attivo di XYS su apprendimento e memoria, i nostri risultati suggeriscono che la principale fonte di fitoestrogeni in XYS è un candidato degno di ulteriori indagini. La ricerca di antidepressivi può anche fornirci alcuni indizi. Jiali Liu et al. hanno scoperto che Bupleuri radix (Chaihu) è il principale farmaco antidepressivo nella prescrizione XYS sulla base dell’analisi siero-farmacologica della frazione di etere di petrolio. Lo studio in vitro ha mostrato che l’estratto di Bupleuri radix ha promosso la proliferazione delle cellule di neuroblastoma attraverso l’attivazione del percorso PI3K/AKt. L’attivazione di PI3K è stata osservata anche nel nostro studio.
Le attuali relazioni cliniche mostrano che XYS ha un significativo effetto terapeutico antidepressivo, ma non esiste un chiaro studio tossicologico sulla tossicità e sugli effetti collaterali di XYS in dettaglio. In generale, XYS può essere considerato come una prescrizione senza troppi effetti collaterali. XYS ha diverse ricette modificate, i cui ingredienti di base sono gli stessi di XYS. Una recente meta-analisi ha valutato l’efficacia e la sicurezza di XYS modificato nel trattamento della sindrome perimenopausale. I risultati raggruppati suggeriscono che XYS modificato potrebbe essere più efficace e più sicuro per il trattamento della sindrome perimenopausale rispetto alla terapia ormonale sostitutiva. Tuttavia, a causa della scarsa metodologia degli studi inclusi, l’efficacia e la sicurezza di XYS hanno bisogno di prove più rigorose per la conferma. Utilizzando il metodo della risonanza magnetica nucleare 1H (NMR), il gruppo di ricerca di Xiaoxia Gao ha riferito che la frazione di etere di petrolio contenente componenti lipofili era la frazione più efficace per il trattamento della depressione. Hanno anche riferito che Bupleuri Radix, il principale componente antidepressivo, potrebbe produrre più effetti tossici nel fegato o nel rene di ratti sani che in ratti con stress cronico imprevedibile lieve. Gli effetti tossici erano associati all’aumento della concentrazione di acidi biliari, alla facilitazione della degradazione della lisina e all’alterazione metabolica di sfingolipidi, glicerofosfolipidi e acidi grassi. Questo risultato è stato corroborato in un recente studio metabolomico su pazienti con depressione. XYS ha svolto un ruolo antidepressivo regolando la sintesi di leucina, valina e isoleucina e il metabolismo di acido binario, acido grasso, argina e prolina. Questi studi suggeriscono che è necessario monitorare da vicino lo stato del paziente con un tempestivo aggiustamento della dose del farmaco per prevenire effetti collaterali tossici.
5. Conclusioni
In questo studio, abbiamo dimostrato che il trattamento con XYS ad alte dosi aveva un’efficacia simile a quella di E2 nel migliorare le capacità cognitive dei ratti OVX. L’effetto terapeutico è stato mediato dalla protezione dei neuroni dell’ippocampo e dal ripristino del livello di E2 dell’ippocampo. La via di segnalazione ERα-PI3K era coinvolta nel processo. Il nostro studio suggerisce che XYS potrebbe essere un’opzione per il trattamento del deterioramento cognitivo in perimenopausa. Attualmente, XYS è usato principalmente nel trattamento dell’ansia clinica e della depressione. Sono necessari più dati clinici per verificare il suo effetto sul miglioramento della funzione cognitiva.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili presso gli autori corrispondenti su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in nessuna forma.
Contributi degli autori
Lina Liu e Fei Ge hanno contribuito equamente a questa ricerca.
Riconoscimenti
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 81603578, 81503536, 81673795, e 81903974); la Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant no. BK20181235); il Jiangsu Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine (Grant no. YB2017066); il Nanjing Science and Technology Development Plan Project (Grant no. 201715072); il progetto dell’ospedale della provincia di Jiangsu per la medicina cinese (sovvenzione n. Y2018CX09); e un progetto finanziato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.