17.4 Valutazione
La valutazione dei cambiamenti nell’immunocompetenza a causa di fattori ambientali, come stress, nutrizione, tossici, o eventi della storia della vita (ad esempio, muta, migrazione, riproduzione), richiede un approccio sistematico che produca risultati che prevedano una protezione “mondiale reale” contro malattie infettive e neoplastiche. È importante che la valutazione sia in grado di distinguere tra cambiamenti positivi nell’immunocompetenza e potenziali cambiamenti avversi, tra cui immunosoppressione, immunostimolazione avversa, immunogenicità, ipersensibilità e autoimmunità.
È stato sviluppato un pannello standardizzato di test per valutare l’immunosoppressione dovuta a sostanze tossiche. Tuttavia, questo pannello non è stato testato per la rilevanza di forme più fisiologiche di immunomodulazione come quelle dovute a stress, nutrizione o eventi della storia della vita. Un’ampia ricerca in immunotossicologia indica che una vasta gamma di test altamente quantitativi è necessaria per prevedere l’efficacia del sistema immunitario per contrastare le malattie infettive e neoplastiche, e che non esiste un singolo test di una funzione immunitaria che sia sufficiente. Il pannello immunotox include misure generali di salute (per esempio, peso corporeo, assunzione di cibo, conta differenziale dei leucociti), il peso e l’istopatologia degli organi immunitari primari e secondari, e saggi funzionali delle risposte immunitarie agli antigeni. I saggi funzionali che integrano tutti i processi cellulari e regolatori responsabili dell’espressione dei principali bracci dell’immunità sono inizialmente più informativi. Una volta ottenuta un’indagine generale del sistema immunitario, gli studi diretti a svelare i meccanismi specifici responsabili sono illuminanti. L’uso di composti di riferimento (ad esempio, azatioprina, desametasone, ciclofosfamide, ciclosporina A) o sostanze nutritive è anche importante per i confronti inter-saggio, inter-laboratorio e inter-specie.
Gli studi progettati per esaminare gli effetti ambientali generali sull’immunocompetenza, compresi lo stress e la dieta, dovrebbero includere misure di immunità sia costitutiva che inducibile fornite dai bracci innati e adattativi del sistema immunitario. I saggi in vivo sono inizialmente i più appropriati perché i cambiamenti nella funzione immunitaria sono spesso il risultato di cambiamenti nell’ambiente ormonale, nutrizionale e fisico a cui sono esposti i leucociti. Inoltre, le curve dose-risposta sono cruciali perché gli effetti di nutrienti, tossici e ormoni non sono lineari e sono spesso bifasici.
Per i test in vivo delle risposte anticorpali, gli antigeni benigni (ad esempio, emocianina della patella, globuli rossi di pecora, patogeni uccisi) consentono la misurazione delle risposte immunitarie indipendentemente da un’infezione in corso. L’uso di vaccini vivi-attenuati per sondare le difese immunitarie è irto di problemi di interpretazione. Una grande risposta potrebbe essere dovuta a una migliore capacità di rispondere alla dose di sfida. In alternativa, potrebbe essere dovuta a un’immunocompetenza sufficientemente scarsa dell’animale in modo che la dose di sfida si replichi rapidamente, fornendo una sfida più grande e persistente e, di conseguenza, richiedendo una risposta più sostenuta e vigorosa. Non è raro che l’immunomodulazione nutrizionale produca effetti molto diversi sulla risposta immunitaria a seconda che il vaccino sia vivo-attenuato o ucciso. Studi approfonditi su roditori esposti a sostanze chimiche tossiche indicano che gli antigeni dipendenti dalle cellule T danno risultati migliori nello screening iniziale dell’immunocompetenza rispetto agli antigeni indipendenti dalle cellule T.
I test in vivo delle risposte cellulo-mediate (Th1) sono importanti, e in immunotossicologia è stata adottata la risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) agli antigeni di richiamo. Nell’immunologia aviaria, la lectina PHA viene talvolta utilizzata a questo scopo, misurando la quantità di gonfiore che induce in seguito all’iniezione nella rete delle ali o delle dita. Tuttavia, l’uso di PHA è irto di problemi di interpretazione perché il gonfiore è dovuto sia all’infiammazione che all’infiltrazione dei linfociti. Pertanto, non è possibile distinguere le risposte innate e mediate dai linfociti T con questo test.
I risultati degli esperimenti in vivo possono talvolta essere ulteriormente esplorati in colture ex vivo di sangue intero diluito. Il sangue intero mantiene gran parte del milieu nutrizionale e ormonale che si trova in vivo, mentre la purificazione dei leucociti seguita dalla cultura in un mezzo generico con siero estraneo rimuove molti importanti fattori di regolazione che spesso guidano i cambiamenti nell’immunità. Gli esperimenti ex vivo sono altamente sensibili ai cambiamenti negli ormoni dello stress circolanti. Per esempio, gli effetti immunosoppressivi di soli 30 minuti di stress acuto sono evidenti nella capacità del sangue intero di uccidere Escherichia coli.
La resistenza dell’ospite alle sfide con organismi infettivi è fondamentale per la valutazione finale dell’immunomodulazione. Sfortunatamente, questo importante passo viene fatto raramente a causa della spesa. Quando si quantifica la protezione, si dovrebbero usare organismi di sfida che sondano le risposte immunitarie Th1, Th2 e infiammatorie per distinguere l’immunosoppressione da uno spostamento dell’enfasi della risposta (cioè l’immunomodulazione). Nei test di immunotossicologia nei roditori, i composti che causano cambiamenti moderati negli indici di immunocompetenza non sempre si traducono in cambiamenti nella resistenza a patogeni autentici. Questo è probabilmente dovuto alla notevole ridondanza e sovrapposizione dei sistemi di effettori immunitari. Al contrario, i composti che non producono alcuna prova di cambiamenti nei test funzionali dell’immunità non sono in grado di influenzare la resistenza agli agenti patogeni o ai tumori.
Infine, lo stadio di sviluppo influenza la sensibilità del sistema immunitario alla perturbazione. Il sistema immunitario in via di sviluppo è più suscettibile alle tossine di quello dell’adulto, e questa situazione è generalmente ritenuta vera per le carenze nutrizionali, anche se poche ricerche si sono concentrate su questo confronto negli uccelli. Per i tossici, l’esposizione durante lo sviluppo può avere diversi effetti qualitativi (cioè, diversi parametri immunitari sono interessati) così come gli effetti quantitativi (cioè, la dose minima efficace e la curva dose-risposta). Gli insulti durante lo sviluppo possono anche avere effetti più persistenti, a volte causando immunosoppressione per tutta la vita.
Studiare l’immunità negli uccelli che vivono liberi ha molte limitazioni derivanti dalle difficoltà di catturare e ricatturare gli individui, gli artefatti da stress dopo la cattura, la specificità di specie dei reagenti, e le piccole dimensioni della maggior parte degli uccelli che vivono liberi (vedi capitolo 22). Mantenere gli uccelli liberi in cattività impone molte pressioni come lo stress e una dieta e un allevamento inappropriati. Anche 15-30 minuti di stress da cattura possono influenzare gli indici di immunità innata e confondere l’interpretazione dei risultati. Pertanto, è auspicabile campionare gli uccelli rapidamente dopo la cattura e condurre le analisi su un singolo campione di sangue.