Prodotti chimici e reagenti
GT è stato acquistato dal mercato di Taichung, Taiwan. IS (purezza 97%) è stato ottenuto da Alfa Aesar (Lancaster, UK). 6,7-dimetossicumarina (6,7-DMC, purezza 98%) è stato fornito da Aldrich Chemical Co. Ltd. (Milwaukee, WI, U.S.A.). EC (purezza 90%), ECG (purezza 98%), EGCG (purezza 95%), acido formico, probenecid, acido fosforico (glaciale, 85%) e methyl-paraben sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. Ltd. (St. Louis, MO, U.S.A.). L’EGC (purezza 92,7%) è stato ottenuto dalla ChromaDex, Inc. (Irvine, CA, U.S.A.). e l’acetato di etile erano di grado LC e sono stati ottenuti da ECHO Chemical Co. Ltd. (Miaoli Hsien, Taiwan). L’acetonitrile era di grado LC/MS ed è stato acquistato da Millinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, U.S.A.). Il siero fetale bovino è stato ottenuto da Biological Industries Inc. (Kibbutz, Beit Haemek, Israele). Penicillina-Streptomicina-Glutamina, Dulbecco’ s Modified Eagle Medium, tripsina/EDTA, Hank’s Balanced Salt Solution e 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid sono stati acquistati da Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.A.). Il Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 è stato ottenuto dalla Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, U.S.A.). La 6-carbossifluoresceina è stata acquistata dalla AAT Bioquest Inc. (Sunnyvale, CA, U.S.A.) e la 5-carbossifluoresceina è stata ottenuta da Acros Organics (Geel, Belgio). L’acqua Milli-Q plus (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.) è stata utilizzata per tutte le preparazioni.
Preparazione e caratterizzazione dell’infuso di GT
L’infuso è stato prodotto dalla macerazione di 2 o 4 g di GT in 50 mL di acqua deionizzata calda (98-100 °C) per 30 minuti. L’infusione è stata filtrata con una garza a caldo per ottenere concentrazioni di 40 e 80 mg/mL, rispettivamente, che sono state appena somministrate ai ratti per via gastrica.
Per la caratterizzazione dell’infusione GT, dopo la filtrazione dell’infusione GT con un filtro RC15 da 0,2 μm (Sartorious, Goettingen Germania), 100 μL del filtrato sono stati mescolati con 900 μL di metanolo e centrifugati per rimuovere il precipitato. L’infuso opportunamente diluito (50 μL) è stato combinato con 50 μL di soluzione 6,7-DMC (2,0 μg/mL in metanolo) come standard interno e 5 μL sono stati sottoposti ad analisi LC-MS/MS. Il sistema HPLC comprendeva la pompa Accela 1250 e l’autocampionatore (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). La separazione cromatografica è stata ottenuta utilizzando una colonna analitica Phenomenex® C18 (150 mm × 1,0 mm, 5 μm) con un prefiltro. La fase mobile era costituita da acetonitrile contenente lo 0,01% di acido formico (A) e acqua contenente lo 0,01% di acido formico (B) e programmata a gradiente come segue: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) e 2/98 (12 min). La velocità di flusso era di 0,2 mL/min. L’effluente della colonna è stato rilevato dalla sonda H-ESI (heated-electrospray ionization) -II con lo spettrometro di massa Quantum Access MAX triple stage quadrupole (TSQ) (Thermo Fisher Scientific Inc. U.S.A.). L’azoto è stato utilizzato come gas di guaina a 35 unità arbitrarie e il gas ausiliario a 10 unità arbitrarie. L’energia di collisione è stata impostata a -19/18 V, la tensione di spruzzo a -3000/3000 V, la temperatura del capillare a 350 °C, la temperatura del vaporizzatore a 350 °C e l’offset della lente del tubo a -80/88 V. Le seguenti transizioni di massa sono state utilizzate per l’analisi di monitoraggio delle reazioni selezionate (SRM): EC (289/245), EGC (305/125), ECG (441/289), EGCG (457/169) e 6,7-DMC (207/151). Gli spettri ESI-MS sono stati registrati in modalità ione negativo per EC, EGC, ECG ed EGCG e in modalità ione positivo per 6,7-DMC.
Animali
Ratti maschi Sprague-Dawley (270-360 g) sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) e alloggiati in ambiente condizionato con cicli luce/buio di 12 ore. Cibo e acqua sono stati acquisiti ad libitum fino a 12 ore prima degli esperimenti. I ratti sono stati divisi in due gruppi. Il primo esperimento ha utilizzato 28 ratti per determinare l’effetto del GT sui livelli sierici di IS e PCS nei ratti CRF; il secondo esperimento ha utilizzato 14 ratti per valutare l’effetto del GT sulla funzione renale dei ratti CRF. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in stretta conformità con le raccomandazioni del ”The Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals (2002)” pubblicato dalla Chinese Society of Animal Science, Taiwan, R.O.C. Il protocollo sperimentale era stato rivisto e approvato il 08/01/2014 (Permesso numero: 103-126-N) dal Insititutional Animal Care and Use Committee of China Medical University, Taiwan, R.O.C.
Istituzione del modello CRF e la somministrazione di infusione GT
CRF è stato indotto tramite somministrazione orale di adenina seguendo studi precedenti, ma con alcune modifiche19,23,35,36. Brevemente, l’adenina sospesa in 0,5% metilcellulosa 400 (15 mg/mL) è stata somministrata per via orale a 28 ratti tramite gastrite due volte al giorno per sette dosi consecutive (15 mg/rat) per tutto il periodo sperimentale. Il giorno 4, i livelli sierici di IS sono stati determinati. Dopo aver confermato l’attenuazione della funzione renale attraverso un aumento significativo dei livelli sierici di IS, i ratti CRF sono stati divisi in tre gruppi (8-10 ratti in ogni gruppo) con livelli di IS comparabili. Il primo gruppo ha ricevuto 400 mg/5 mL/kg di GT in infusione due volte al giorno per sette dosi consecutive; il secondo gruppo ha ricevuto 200 mg/5 mL/kg di GT due volte al giorno per sette dosi consecutive; e il terzo gruppo ha ricevuto 5 mL/kg di acqua in parallelo come controllo. Il giorno 8, ai ratti è stata somministrata la settima dose di GT alle 9:00 del mattino dopo il digiuno notturno e i campioni di sangue sono stati raccolti a 0, 15, 30, 60, 120, 180 e 360 minuti dopo la somministrazione. Il tempo previsto per la raccolta del sangue e le somministrazioni di adenina e GT sono riassunte nella Fig. 3. Ad ogni tempo di campionamento, 0,5 mL di sangue sono stati prelevati in anestesia isoflurano. I campioni di sangue sono stati raccolti in microtubi e centrifugati a 10.000 g per 15 minuti per ottenere il siero, che è stato conservato a -20 °C prima dell’analisi.
Determinazione delle concentrazioni di IS e PCS nel siero
Per la determinazione delle concentrazioni di IS e PCS nel siero, 50 μL di campione di siero sono stati agitati con 200 μL di metanolo contenente 10 μg/mL di 6,7-DMC o 100 μg/mL di metilparabene come standard interni, rispettivamente e centrifugati per rimuovere il precipitato, poi un’aliquota di 20 μL è stata sottoposta ad analisi HPLC.
Per le preparazioni del calibratore, 50 μL di siero sono stati sottoposti a una serie di concentrazioni di IS e PCS per permettere intervalli di concentrazione di 0,4-25,0 μg/mL (1,8-117,3 μM) e 0,3-20,0 μg/mL (1,7-106,3 μM), rispettivamente. La procedura successiva ha seguito quella descritta sopra per i campioni di siero. Le curve di calibrazione sono state tracciate mediante regressione lineare dei rapporti delle aree di picco (IS o PCS allo standard interno) contro le concentrazioni note di IS e PCS, rispettivamente.
L’apparato HPLC comprendeva una pompa (LC-10AT, Shimadzu, Kyoto, Giappone), un rilevatore di fluorescenza (RF-20A, Shimadzu, Kyoto, Giappone) e un iniettore automatico (SIL-10AF, Shimadzu, Kyoto, Giappone). La colonna Apollo C18 (5 μm, 4,6 mm × 250 mm, Alltech, Deerfield, IL, USA) era dotata di una colonna di guardia (4,6 × 50 mm, 5 μm) (GL Science Inc., Tokyo, Giappone). La fase mobile era costituita da acetonitrile (A)-0,1% di acido fosforico (B) e programmata in modo gradiente come segue: A/B: 15/85 (0-7 min), 30/70 (9-22 min) e 15/85 (24-35 min) per IS e 16/84 (0-10 min), 30/70 (13-22 min) e 16/84 (24-36 min) per PCS. Le impostazioni del rivelatore erano Ex 280 nm/Em 375 nm per IS e Ex 214 nm/Em 306 nm per PCS. Le velocità di flusso erano 1,0 mL/min.
Effetto del GT su Cr e BUN nei ratti CRF
In un altro esperimento, lo stesso protocollo animale menzionato sopra è stato impiegato e le concentrazioni di Cr e BUN sono state determinate prima del trattamento con adenina (giorno 0), prima della somministrazione del GT (giorno 4) e dopo la settima dose di GT (giorno 8). Dopo aver confermato l’attenuazione della funzione renale con un aumento significativo di Cr e BUN il giorno 4, i ratti CRF sono stati divisi in due gruppi (7 ratti per gruppo) con livelli di Cr comparabili. Il primo gruppo ha ricevuto 400 mg/5 mL/kg di GT due volte al giorno per sette dosi consecutive; il secondo gruppo ha ricevuto 5 mL/kg di acqua in parallelo come controllo. Il giorno 8, ai ratti è stata somministrata la settima dose di GT e acqua dopo il digiuno notturno e i campioni di sangue sono stati raccolti 30 minuti dopo. Il Cr è stato determinato con un metodo di picrato alcalino cinetico in un ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Health Care Diagnostics, Inc. Tarrytown, NY, U.S.A.). Il BUN è stato dosato mediante la reazione ureasi/glutammato deidrogenasi accoppiata con lo stesso analizzatore.
Linea cellulare e condizioni di coltura
La costruzione delle linee cellulari trasfettate in modo stabile utilizzate per gli studi di trasporto, cellule dell’ovaio di criceto cinese (CHO) che esprimono hOAT1 (CHO-hOAT1), cellule del rene embrionale umano 293 (HEK) che esprimono hOAT3 (HEK-hOAT3) e le loro corrispondenti linee cellulari di controllo trasfettate con vettore vuoto, è stata descritta precedentemente40,41. Le cellule CHO sono state mantenute a 37 °C con 5% CO2 in media DMEM F-12 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) contenente 10% di siero, 1% penicillina/streptomicina e 1 mg/mL G418. Le cellule HEK sono state mantenute a 37 °C con il 5% di CO2 in DMEM high glucose media (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) contenente 10% di siero, 1% di penicillina/streptomicina e 50 μg/mL di igromicina B. Le cellule sono state coltivate in piatti rivestiti di Poly-D-Lisina.
Preparazione e caratterizzazione dei metaboliti sierici di GT (GTM)
Al fine di imitare le molecole che interagiscono con OATs in vivo, GTM sono stati preparati da ratti e caratterizzato. In breve, l’infusione di GT (800 mg/10 mL/kg) è stata somministrata per via orale a ratti a digiuno durante la notte. Il sangue è stato raccolto 15 minuti dopo il dosaggio dell’infusione di GT. Dopo la coagulazione, il siero è stato raccolto e vortexato con 3 volte il metanolo. Dopo la centrifugazione a 10.000 g per 15 minuti, il surnatante è stato concentrato in un evaporatore rotante sotto vuoto fino a secchezza. Un volume adeguato di acqua è stato aggiunto al residuo ottenendo una soluzione con 10 volte la concentrazione del siero, che è stato diviso in aliquote e conservati a -80 ° C per un uso successivo.
Una porzione di GTM è stato caratterizzato seguendo un metodo precedente con alcune modifiche 16,46. Brevemente, 100 μL di campione di siero è stato miscelato con 50 μL di solfatasi (contenente 1000 unità/mL di solfatasi e 39.861 unità/ml di ß-glucuronidasi), 50 μL di acido ascorbico (200 mg/mL) e incubato a 37 °C per 45 min in condizioni anaerobiche. Dopo l’idrolisi, il siero è stato aggiunto a 50 μL di HCl 0,1 N e poi partizionato con 250 μL di acetato di etile (contenente 100 ng/mL di 6,7-DMC come standard interno). Lo strato di acetato di etile è stato evaporato sotto N2 a secco e ricostituito con un volume adeguato di fase mobile prima di LC-MS / MS analisi. La fase mobile consisteva di acetonitrile (A) – acqua contenente 0,1% di acido formico (B) e programmato in modo gradiente come segue: A/B: 2/98 (0-2 min), 15/85 (4 min), 40/60 (6 min), 90/10 (8-10 min) e 2/98 (12 min). La velocità di flusso era di 0,2 mL/min.
Effetti del GTM sul trasporto di assorbimento mediato da hOAT1 e hOAT3
Le cellule CHO-hOAT1 e HEK-hOAT3 (1 × 105 cellule/pozzetto) sono state coltivate in una piastra a 96 pozzetti. 6-Carboxyfluorescein (6-CF) e 5-carboxyfluorescein (5-CF) sono stati utilizzati come sonde per valutare l’effetto di GTM sull’attività di hOAT1 e hOAT3, rispettivamente47,48. Inoltre, probenecid (80 μM) è stato utilizzato come controllo positivo per l’inibizione di hOAT1 e hOAT349. Dopo 24 h o 48 h di incubazione di CHO-hOAT1 o HEK-hOAT3, il mezzo è stato rimosso e lavato tre volte con tampone PBS. Prima dell’esperimento di trasporto, le cellule CHO-hOAT1 e HEK-hOAT3 sono state pre-incubate con agenti di prova (GTM e probenecid) a 37 °C. Dopo 30 min di incubazione, 6-CF o 5-CF è stato poi aggiunto e incubato per altri 5 min e 10 min, rispettivamente. Le piastre sono state immediatamente poste su un bagno di ghiaccio e i surnatanti sono stati rimossi e le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo come il ghiaccio. Successivamente, sono stati aggiunti 100 μL di Triton X-100 allo 0,1% per lisare le cellule e la fluorescenza è stata misurata con eccitazione a 485 nm ed emissione a 528 nm. Per quantificare il contenuto di proteine in ogni pozzetto, 10 μL di lisato cellulare sono stati aggiunti a 200 μL di reagente per il saggio delle proteine diluito (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.) e la densità ottica è stata misurata a 570 nm. L’accumulo intracellulare relativo di 6-CF o 5-CF è stato calcolato confrontandolo con quello dei controlli dopo la correzione delle proteine.
Analisi dei dati
La concentrazione sierica di picco (Cmax) è stata ottenuta dall’osservazione sperimentale. L’area sotto la concentrazione sierica – curva temporale (AUC0-t) è stata calcolata usando la regola trapezoidale fino all’ultimo punto. Le differenze di IS e PCS tra i tre gruppi sono state analizzate utilizzando l’ANOVA a una via, mentre la differenza di Cr e BUN tra due gruppi è stata analizzata utilizzando il test t di Student non abbinato, prendendo p < 0,05 come livello significativo. Il t-test di Student non appaiato è stato utilizzato anche per l’analisi dei test in vitro.