In questo studio abbiamo ipotizzato che diversi metodi di isolamento di RNA avranno un impatto sui risultati quando si analizza l’espressione genica nei tessuti. I metodi di estrazione dell’RNA possono essere ampiamente caratterizzati in estrazione fenolo:cloroformio seguita da precipitazione con alcool (TRIzol), fenolo:cloroformio seguita da estrazione in fase solida (a colonna; miRVana e miRNeasy) e separazione in fase solida con/senza resina di affinità (Norgen total e Isolate II). Queste metodologie sono state sviluppate principalmente per l’estrazione di mRNA lunghi e si sono basate sul presupposto che tutti gli RNA vengono purificati allo stesso modo. Inoltre, ci sono una serie di considerazioni per scegliere un particolare metodo di estrazione dell’RNA come la qualità, la quantità, il prezzo e la facilità d’uso (tempo di estrazione). Qui, presentiamo dati che mostrano il metodo utilizzato per estrarre l’RNA produrrà anche risultati variabili rispetto a diversi metodi in applicazioni a valle e quindi è un’altra considerazione importante.
Questo studio dimostra che i metodi di isolamento RNA variano in termini di quantità e qualità dei campioni di RNA, e nell’analisi di miRNA e espressione del gene bersaglio. Abbiamo scelto organi che possono essere difficili da isolare l’RNA per diverse ragioni. Per esempio, l’isolamento dell’RNA dal cervello è spesso noto per risultare in basse rese a causa del suo alto contenuto di lipidi. Questo era particolarmente evidente con il kit Bioline Isolate II. Il protocollo dei produttori suggerisce che fino a 5 μg di RNA dovrebbe essere purificato da 10 mg di cervello di topo/ratto. Tuttavia, il manuale miRNeasy suggerisce che 5-20 μg di RNA dovrebbe essere ottenibile dal cervello con la stessa quantità di materiale di input. Risoluzione dei problemi sul sito web del produttore descrive un problema con i tessuti ricchi di lipidi è intasamento della colonna e suggerisce diminuire la quantità di campione o aumentare il volume del tampone di lisi. Le nostre estrazioni sono state eseguite entro i limiti suggeriti dal protocollo. Successivamente, suggeriscono di eseguire la pre-estrazione usando il reagente TRIsure (l’equivalente Bioline di TRIzol) e poi la separazione su colonna con il kit per pulire la fase acquosa. Questo metodo sarebbe quindi paragonabile ai metodi di estrazione dell’RNA miRVana e miRNeasy e potrebbe portare a rendimenti migliori per questo tessuto. Inoltre, la qualità dell’RNA è correlata alle risposte specifiche del tessuto allo stress fisiologico sia prima che dopo la morte del tessuto. Tessuti come il polmone e il fegato hanno caratteristicamente basso RINs e un piccolo picco 28S come questi tessuti sono inclini a degradazione più veloce di RNA da alti livelli di nucleasi. Per inattivare le nucleasi il tessuto viene rapidamente congelato e lo scongelamento viene impedito fino a quando il materiale pesato viene aggiunto al tampone di estrazione. Anche se lo scongelamento del tessuto è stato impedito, non possiamo escludere che il tempo trascorso dall’eutanasia dell’animale e dall’escissione degli organi al congelamento rapido sia un fattore che contribuisce ai valori RIN complessivamente bassi e ad alcuni prodotti di degradazione osservati con tutti i campioni di polmone, indipendentemente dal kit di isolamento utilizzato. Un metodo alternativo per inattivare le nucleasi è l’utilizzo di una soluzione stabilizzante dell’RNA come RNAlater (ThermoFisher Scientific), che permette ai campioni di tessuto non congelati di essere processati successivamente. Può aiutare a garantire l’integrità dell’RNA, ma non è compatibile con tutte le procedure di isolamento dell’RNA e gli utenti dovrebbero controllare il loro metodo specifico prima di eseguire le estrazioni. L’aggiunta di un picco dopo 60 s in alcuni campioni nell’analisi del Bioanalyser suggerisce una contaminazione da gDNA. Un trattamento DNase aggiuntivo può essere eseguito sulle colonne con alcuni kit, tuttavia un passaggio di eliminazione del gDNA è altamente raccomandato durante la fase di trascrizione inversa. L’inclusione di questo passaggio nei nostri metodi può spiegare perché non c’è stata alcuna interferenza nell’analisi dell’espressione dell’mRNA dei campioni di polmone Norgen, ma ha avuto un impatto sull’analisi dell’espressione del miRNA poiché il protocollo del test Taqman miRNA non include la rimozione del gDNA. Inoltre, la purezza dei campioni di RNA è un fattore critico in quanto anche se i campioni con RIN > 7 dovrebbero funzionare bene nella maggior parte delle applicazioni a valle, quelle che comportano reazioni enzimatiche come la qPCR possono essere inibite da nucleasi, ioni metallici o contaminanti organici. In generale, i campioni di RNA di Bioline Isolate II avevano rapporti 260/230 inferiori e i contaminanti potrebbero contribuire alle sue scarse prestazioni. Infine, sono state osservate differenze nell’arricchimento per i miRNA nella preparazione dell’RNA totale. Poiché i miRNA rappresentano una piccola frazione del repertorio complessivo di RNA, può essere difficile determinare il loro contributo dall’analisi di integrità. Il saggio Qubit microRNA offre un rilevamento altamente selettivo di basse quantità di piccoli RNA anche in presenza di contaminanti comuni. Percentuali elevate di miRNA sono state comunemente rilevate con i metodi di estrazione miRVana e Norgen, tuttavia, data l’analisi di integrità per le preparazioni di RNA totale Norgen, è possibile che l’arricchimento di miRNA possa essere sovrastimato poiché i frammenti di RNA più piccoli vengono rilevati in seguito alla degradazione o all’ossidazione di RNA più grandi (mRNA, rRNA o tRNA) o, nel caso dei campioni di polmone, la contaminazione del DNA perturbando i risultati Qubit. Quindi, la quantità, la qualità e la purezza dei campioni di RNA sono fattori molto importanti per la scelta di un particolare metodo di estrazione dell’RNA e ulteriori ricerche su come ottimizzare questi metodi per il tuo tessuto di interesse possono aiutare a migliorarli.
La profilazione dei miRNA può fornire informazioni come biomarcatori per applicazioni diagnostiche o prognostiche. Per esempio, i pannelli di miRNA possono essere utilizzati per classificare diversi fenotipi di cancro, prevedere la recidiva o la risposta alle terapie. Tuttavia, per la scoperta e l’applicazione clinica dei biomarcatori basati sui miRNA è necessario ottimizzare e standardizzare le pratiche di estrazione dell’RNA per evitare risultati contrastanti. Per esempio, una meta-analisi di 63 studi pubblicati da Zhou et al. (2014) ha trovato risultati incoerenti e persino contrastanti nel valutare il valore prognostico dell’oncomiR, miR-21 . Gli autori attribuiscono l’eterogeneità alle differenze nella fonte dei campioni, i metodi di rilevamento e i metodi di normalizzazione, ma non alludono ai metodi di estrazione dell’RNA, che noi mostriamo contribuire anche.
Le funzioni biologiche e gli obiettivi di pochi miRNA sono stati convalidati sperimentalmente, ma questo è fondamentale per realizzare il potenziale della terapia basata sui miRNA. Inoltre, scoprire le funzioni biologiche tessuto-specifiche aiuterà a identificare la loro azione terapeutica e i potenziali effetti off-target nei tessuti normali. La convalida delle interazioni miRNA-mRNA viene eseguita principalmente in saggi di coltura cellulare, che comportano la manipolazione artificiale dei miRNA endogeni. Tuttavia, i livelli raggiunti attraverso la manipolazione della cultura cellulare (ad esempio la trasfezione di mimici) non sono di solito a livelli fisiologici osservati in vivo, quindi, è importante ricapitolare i risultati in modelli animali appropriati. Attualmente, nessun rapporto ha confrontato direttamente miRNA e gene bersaglio rilevamento da campioni di RNA totale utilizzando diversi metodi di estrazione. Mostriamo che i metodi di estrazione di RNA differiscono nella loro efficienza nell’isolare sia RNA breve e lungo e quindi attenta considerazione deve andare nella scelta di un metodo appropriato se si desidera rilevare entrambi dallo stesso campione.
La ricerca precedente ha comunemente assunto che tutti i tipi di RNA sono purificati allo stesso modo. Tuttavia, sono emersi diversi rapporti che indicano differenze nell’efficienza di estrazione a seconda del metodo utilizzato per l’isolamento dell’RNA. Kim et al. (2011) hanno ritrattato il loro articolo su Molecular Cell poiché hanno scoperto che le loro conclusioni sulle differenze nell’espressione di miRNA da cellule cresciute a diverse confluenze (alta densità contro bassa densità) e quando sono state staccate dal piatto di coltura (aderenti contro sospensione) erano in realtà spiegate dalle differenze nell’efficienza di estrazione dell’RNA utilizzando il metodo TRIzol. Hanno scoperto che i miRNA con basso contenuto di GC e struttura secondaria stabile sono stati persi durante l’estrazione, piuttosto che essere degradati nelle cellule come avevano inizialmente pubblicato. I risultati precedenti di El-Khoury et al. (2016) hanno trovato differenze nel recupero di miRNA da cellule, plasma ed esosomi derivati da urina/plasma quando si confrontano TRIzol LS, miRNeasy siero/plasma e kit di estrazione del biofluido miRCURY . Gli autori hanno scoperto che il kit miRCURY ha isolato RNA altamente puro ma ha recuperato poco i miRNA, TRIzol ha prodotto RNA di bassa purezza che ha avuto un impatto sull’efficienza della PCR, mentre miRNeasy ha prodotto RNA di scarsa qualità ma ha dato il meglio per il rilevamento dei miRNA. Allo stesso modo, McAlexander et al. (2013) hanno trovato differenze nell’estrazione di miRNA dal plasma e dal liquido cerebrospinale. Hanno confrontato le estrazioni di miRVana, miRCURY Cell and Plant kit e TRIzol LS con e senza glicogeno come vettore. miRVana era simile con o senza glicogeno, mentre miRCURY senza glicogeno aveva un recupero di miRNA leggermente inferiore a miRVana. Tuttavia, il glicogeno ha migliorato notevolmente il recupero di miRNA con il kit miRCURY ma ha esacerbato la bassa resa e la variabilità con l’estrazione TRIzol. Hanno poi continuato a confrontare il kit miRCURY Cell and Plant con i metodi di estrazione di siero/plasma miRCURY Biofluids e miRNeasy con il glicogeno come vettore e hanno scoperto che il miRCURY Biofluids aveva la più alta abbondanza relativa di miRNA esogeno spiked-in e hanno concluso che questo era il metodo superiore per la loro particolare applicazione. Collettivamente, questi studi evidenziano le differenze nel recupero dell’RNA utilizzando diversi metodi di estrazione e suggeriscono la necessità di ottimizzare per la tua cella, tessuto e/o fluido di interesse.
Ci sono diversi passaggi durante il flusso di lavoro che possono introdurre variazioni sperimentali. A cominciare dal metodo per fissare o congelare il tessuto, la conservazione del materiale, il metodo di estrazione dell’RNA, il metodo usato per la trascrizione inversa e l’amplificazione qPCR o altre piattaforme a valle. In questo studio abbiamo cercato di controllare alcune di queste variabili congelando i tessuti, conservandoli a – 80 °C, evitando lo scongelamento prima dell’estrazione e utilizzando le pratiche più raccomandate per l’analisi dell’espressione dei miRNA. Per esempio, l’uso di primer RT specifici per la sequenza rispetto a un primer RT universale ha dimostrato di essere superiore per l’amplificazione di prodotti specifici. La qPCR è considerata il gold standard per l’analisi dell’espressione dei miRNA e dei target grazie alla sua sensibilità e specificità rispetto alle piattaforme di profiling globale. È importante notare che la qualità dei risultati ottenuti è più importante del puro numero di miRNA profilati dalle grandi piattaforme basate sul sequenziamento. Inoltre, anche se non abbiamo confrontato l’effetto di arricchimento di miRNA dai nostri campioni di RNA precedenti rapporti hanno consigliato contro di esso, in particolare per le piattaforme di profilazione globale miRNA. Per esempio, Redshaw et al. (2013) hanno scoperto che la procedura di arricchimento di RNA breve si traduce in livelli di miRNA relativi significativamente inferiori quando si confrontano RNA totale e materiale arricchito, in particolare la procedura di arricchimento ha ridotto il numero di copie di miRNA fino al 25% di quello presente da campioni pre-arricchiti e che questa perdita varia per diverse sequenze di miRNA. Pertanto, i dati di miRNA da preparazioni di RNA totale e corto potrebbero non essere direttamente comparabili. Inoltre, è stato suggerito che l’RNA più grande può agire come un vettore per i piccoli RNA. Se i metodi arricchiti di miRNA per tutte le società si tradurrebbero in un migliore recupero dai tessuti rimane da determinare. Anche se Bioline suggerisce un kit separato per l’isolamento del miRNA, abbiamo usato il kit Isolate II RNA totale per confrontare direttamente con altri metodi di estrazione, poiché il kit specifico per il miRNA non consente l’isolamento di entrambi gli RNA corti e lunghi dalla stessa eluizione. Piuttosto le specie di miRNA sono arricchite e isolate prima, e poi gli RNA lunghi possono essere estratti dopo, ottenendo due frazioni separate. Anche se l’Isolate II non è ottimizzato per isolare i piccoli RNA come i kit miRVana o miRNeasy, non è stato nemmeno superiore per l’espressione del gene target. Data la grande discrepanza tra alcuni kit i ricercatori dovrebbero optare per un metodo di estrazione più robusto.