L’adenosina deaminasi (ADA) è un enzima chiave delle vie di salvataggio delle purine e la carenza causata da mutazioni nel gene ADA risulta in una delle cause più comuni di immunodeficienza combinata grave autosomica recessiva (SCID), che rappresenta circa il 10-15% dei casi nelle popolazioni outbred. La funzione ADA assente o compromessa porta all’accumulo dei metaboliti tossici adenosina, 2’deossiadenosina e deossiadenosina trifosfato (dATP). La SCID con deficit di ADA è caratterizzata da una grave linfocitopenia che colpisce i linfociti T e B e le cellule NK, ma, a causa della natura ubiquitaria dell’enzima, si osservano anche manifestazioni non immunologiche, tra cui deficit dello sviluppo neurologico, sordità neurosensoriale e anomalie scheletriche. L’incidenza del deficit di ADA in Europa è stimata tra 1:375.000 e 1:660.000 nati vivi. La diagnosi precoce della SCID con deficit di ADA e l’inizio del trattamento sono essenziali in questa condizione altrimenti fatale. Le attuali opzioni di trattamento includono la terapia enzimatica sostitutiva (ERT), il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) e la terapia genica autologa (GT).
Biochimica
ADA è un enzima metabolico ubiquitariamente espresso, anche se il livello di attività enzimatica varia, con i livelli più alti osservati nei tessuti linfoidi, in particolare il timo, il cervello e il tratto gastrointestinale, ed è espresso sia intracellularmente che sulla superficie cellulare in complesso con CD26 . Con la fosforilasi dei nucleosidi purinici, forma un componente essenziale della via di salvataggio delle purine, responsabile della deaminazione irreversibile dell’adenosina e della 2’deossiadenosina in inosina e 2’deossinosina rispettivamente. Una funzione assente o compromessa comporta di conseguenza un accumulo intracellulare ed extracellulare di questi substrati. L’adenosina deriva principalmente dalla scomposizione dell’adenosina trifosfato (ATP) e dell’RNA, e la 2’deossiadenosina dalla scomposizione del DNA. La 2’deossiadenosina inibisce irreversibilmente l’enzima S-adenosilomocisteina (SAH) idrolasi causando l’accumulo di SAH, che successivamente impedisce i processi di metilazione mediati dalla S-adenosilmetionina necessari per la normale differenziazione dei timociti, contribuendo probabilmente alla compromissione dello sviluppo dei linfociti T evidente nel deficit di ADA. L’aumento dell’assorbimento intracellulare di 2’deossiadenosina seguito dalla fosforilazione da parte della deossicitidina chinasi porta all’accumulo di deossiadenosina trifosfato (dATP) che inibisce la ribonucleotide reduttasi, impedendo la normale sintesi e riparazione del DNA. L’adenosina è un’importante molecola di segnalazione extracellulare; si pensa che l’interruzione di queste vie di segnalazione interferisca con le normali risposte immunitarie. I recettori dell’adenosina appartengono alla famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G, di cui esistono quattro sottotipi (A1, A2A, A2B e A3), che svolgono ruoli diversi nella regolazione della normale fisiologia cellulare in un’ampia varietà di tessuti tra cui il cervello, il sistema cardiovascolare e i polmoni. I test biochimici dimostrano un’attività ADA assente o molto ridotta (< 1% del normale) e un marcato aumento del metabolita dATP o dei nucleotidi dAdo totali (la somma di dAMP, dADP e dATP) negli eritrociti. Una ridotta attività dell’idrolasi SAH negli eritrociti (< 5% del normale) è anche caratteristica. Se un paziente con sospetto deficit di ADA ha avuto una recente trasfusione di sangue, l’analisi dell’attività di ADA può essere misurata nei genitori, con attività ridotta vista nei portatori eterozigoti, o può essere eseguita su cellule non eritroidi come i leucociti. Anche i fibroblasti possono essere utilizzati, ma le colture di fibroblasti di solito non sono facilmente disponibili e questo può ritardare la diagnosi. La diagnosi genetica molecolare si basa sull’identificazione di mutazioni patogene bi-alleliche nel gene ADA, situato sul cromosoma 20q12-q13.11 e nel quale sono state identificate oltre 70 mutazioni causali.
I risultati di laboratorio di supporto includono la linfocitopenia, con assenza di linfociti T e B e cellule NK e basse immunoglobuline sieriche, anche se nella prima infanzia le IgG possono essere normali a causa del trasferimento materno-placentare. Le risposte proliferative dei linfociti T sono basse o assenti, così come le risposte anticorpali specifiche. È stato dimostrato che il livello di substrati metabolici e il genotipo sono correlati alla gravità del fenotipo clinico.
Manifestazioni cliniche
Sistema immunitario – effetti a livello cellulare
Le conseguenze dominanti della carenza di ADA sono sul sistema immunitario, causando una grave deplezione dei linfociti T e B e delle cellule NK, con conseguente compromissione dell’immunità cellulare e umorale. Alti livelli di ADA sono espressi nei tessuti linfoidi a causa degli alti livelli di turnover cellulare, in particolare nel timo, che probabilmente spiega i gravi effetti linfocitotossici della carenza. I meccanismi sottostanti responsabili degli effetti deleteri sul sistema immunitario sono stati chiariti con l’uso di modelli sperimentali con carenza di ADA. Ci sono effetti pronunciati sullo sviluppo dei timociti, anche se la fase precisa in cui questo si verifica è sconosciuto. Apasov et al. hanno dimostrato un’estesa apoptosi nei timi dei modelli murini ADA(-/-) ma non nei linfonodi periferici e nella milza, dimostrando l’effetto dannoso sui timociti in via di sviluppo. L’apoptosi nei timi era evidente soprattutto nella giunzione cortico-midollare e colpiva in particolare i timociti doppi positivi. Anche i linfociti T periferici erano anormali, con una distribuzione aberrante nei tessuti linfoidi secondari e l’espressione di marcatori cellulari, così come una segnalazione difettosa dei linfociti T attraverso il TCR. Si pensa che la combinazione dell’accumulo intracellulare di substrati tossici e della segnalazione difettosa dei linfociti T contribuisca all’esaurimento dei timociti in via di sviluppo.
Il compartimento dei linfociti B è colpito anche nel deficit di ADA, con pazienti che presentano una grave linfocitopenia B e ipogammaglobulinemia, anche se, a differenza dei linfociti T, lo sviluppo iniziale dei linfociti B non sembra essere disturbato. Si osserva un’architettura anomala del centro germinale splenico che suggerisce un’alterata maturazione dei linfociti B dipendente dall’antigene, e i linfociti B hanno anche mostrato una ridotta capacità proliferativa, una maggiore apoptosi e una segnalazione alterata all’attivazione. Questo suggerisce che il difetto dei linfociti B è più probabile che sia legato a un’alterata differenziazione dovuta a un difetto intrinseco piuttosto che unicamente alla mancanza di un adeguato aiuto dei linfociti T CD4+. L’alterata ricombinazione V(D)J dovuta all’aumento dei livelli di dATP può anche influenzare negativamente la diversità e la funzione dei linfociti B.
Sistema immunitario – manifestazioni cliniche
Come risultato di un’immunità cellulare e umorale gravemente compromessa, la tipica presentazione del deficit di ADA si verifica all’inizio della vita con gravi infezioni e mancato sviluppo, e gli individui affetti normalmente soccombono entro il primo o secondo anno di vita senza intervento. Il quadro clinico di ADA-deficiente SCID è simile ad altre forme genetiche di SCID, con diarrea persistente, dermatiti e gravi infezioni, spesso causate da patogeni opportunistici come Pneumocystis jiroveci, essendo caratteristici. I risultati fisici includono l’assenza della ghiandola del timo sulle radiografie toraciche e l’assenza di tessuti linfoidi.
Fenomeni non immunitari
La natura ubiquitaria dell’ADA significa anche che le conseguenze della carenza non sono limitate ai linfociti, e si osservano anche molte altre caratteristiche sistemiche non immunologiche, con un impatto noto sui sistemi nervoso, uditivo, scheletrico, polmonare, epatico e renale, nonché anomalie cognitive e comportamentali. Le manifestazioni non immunologiche sono diventate più evidenti negli ultimi anni con il miglioramento della sopravvivenza e della ricostituzione immunitaria in seguito al trapianto di cellule staminali, e la consapevolezza e l’identificazione del coinvolgimento di più sistemi d’organo è essenziale per consentire una gestione ottimale e tempestiva.
I bambini con deficit di ADA hanno dimostrato di mostrare una serie di anomalie del comportamento, tra cui deficit di attenzione, iperattività, aggressività e problemi sociali, che sembrano svilupparsi indipendentemente dalle influenze associate al HSCT. I livelli di QI sono più bassi nei bambini con ADA-deficiente SCID rispetto alla media della popolazione e rispetto ai bambini con altre forme di SCID. Alti livelli di espressione di ADA trovati nel cervello, e la scoperta che i punteggi di QI totale correlano con il livello di dATP alla diagnosi, supportano ulteriormente la teoria che il deterioramento cognitivo è sia una conseguenza del disturbo metabolico in ADA-deficienza e dipende dal grado di carenza.
L’ipoacusia neurosensoriale bilaterale è stata riportata per la prima volta in due pazienti con ADA-deficienza che erano stati trattati con successo con HSCT. Le cause strutturali e infettive sono state escluse ed entrambi i pazienti non hanno ricevuto alcun condizionamento prima dell’HSCT, escludendo questa come causa potenziale e implicando il difetto metabolico sottostante. Un’alta prevalenza di perdita uditiva neurosensoriale bilaterale (58%) è stata riportata in una coorte di 12 pazienti con deficit di ADA che erano stati trattati con HSCT. In questo studio, non è stata trovata alcuna relazione tra la sordità e i livelli di dATP.
Il ruolo metabolico dell’adenosina deaminasi e le conseguenze dell’accumulo di substrato tossico nei polmoni è stato dimostrato in modelli sperimentali, con topi ADA(-/-)che mostrano una grave infiammazione polmonare, con accumulo di macrofagi attivati ed eosinofili, e rimodellamento delle vie aeree, reversibile all’inizio della ERT. Modelli di topo hanno anche dimostrato che l’esposizione prolungata ad alte concentrazioni di adenosina nel polmone a causa del trattamento con ERT a basse dosi porta allo sviluppo di fibrosi polmonare, ma questi cambiamenti sono stati invertiti dopo aver ridotto i livelli di adenosina polmonare. Nei pazienti con deficit di ADA si osservano manifestazioni polmonari simili e la malattia polmonare non infettiva, compresa la polmonite e la proteinosi alveolare polmonare (PAP), si riscontra più frequentemente che in altre forme genetiche di SCID. Il 43,8% dei pazienti con ADA-deficiente SCID ha avuto PAP in uno studio che si è risolto rapidamente (in tutti i pazienti tranne uno) dopo l’inizio della ERT.
Anomalie scheletriche come il coinvolgimento delle articolazioni costocondrali sono ampiamente riportati, probabilmente legati ad uno squilibrio tra il fattore nucleare-κB ligando (RANKL) e osteoprotegerina (OPG), disturbando l’interazione tra osteoblasti e osteoclasti e conseguente formazione ossea, anche se le anomalie sono principalmente solo apparente su immagini radiologiche senza conseguenze dismorfiche. L’effetto dei metaboliti tossici sul midollo osseo può svolgere un ruolo nell'”auto-condizionamento” evidente nella SCID con deficit di ADA, con la creazione di nicchie di cellule staminali, facilitando l’incisione delle cellule staminali ematopoietiche del donatore. Tuttavia, le anomalie scheletriche sono state segnalate anche in altre immunodeficienze e la correzione completa dopo la terapia non è vista, suggerendo altri fattori coinvolti nella patogenesi.
Il coinvolgimento epatico nel deficit di ADA sembra differire tra i topi e gli esseri umani. I modelli murini ADA(-/-) mostrano una grave degenerazione epatocellulare che è fatale nel periodo perinatale. In confronto, un grave grado di deterioramento epatico non è normalmente visto in pazienti con ADA-deficiente, anche se c’è un caso di un paziente con ADA-deficiente SCID che ha sviluppato una rapida insufficienza epatica fatale che non potrebbe essere attribuita all’infezione, e un neonato con ADA-deficiente SCID con epatite e iperbilirubinemia che si è risolto con ERT. Le segnalazioni di coinvolgimento renale nel deficit di ADA includono la presenza di sclerosi mesangiale trovata in 7/8 autopsie di pazienti con deficit di ADA, con 6/8 che dimostrano anche sclerosi corticale delle ghiandole surrenali. La sindrome emolitica uremica atipica è stata riportata in 4 pazienti con ADA-deficienza, 2 dei quali hanno recuperato con lieve o nessuna insufficienza renale residua dopo la gestione di supporto e l’inizio della ERT. Dermatofibrosarcoma protuberans è un raro tumore maligno della pelle, che è stato segnalato per verificarsi con maggiore frequenza nei pazienti con ADA-deficienza, ma il meccanismo dietro questo non è chiaro.
Mentre la ADA-deficienza è ampiamente accettato come un disordine metabolico sistemico, è importante considerare che alcune manifestazioni sistemiche sono state riportate solo in un piccolo numero di pazienti. Altri fattori che contribuiscono, come gli agenti infettivi, possono essere coinvolti e sono necessarie ulteriori indagini sulla patogenesi sottostante a queste manifestazioni. Tuttavia, la consapevolezza del coinvolgimento multiorgano è essenziale per la cura ottimale del paziente.
Deficit ADA parziale e ad insorgenza tardiva
C’è eterogeneità nel fenotipo del deficit ADA, con circa il 15-20% dei pazienti che presentano un “esordio clinico ritardato” che si presenta con un deficit immunitario combinato meno grave, ma in graduale peggioramento, più tardi nella vita, solitamente entro la prima decade, ma occasionalmente in età adulta. Le manifestazioni cliniche in questo gruppo a ‘esordio ritardato’ includono infezioni ricorrenti, ma meno gravi, che colpiscono in particolare il tratto sinopolmonare. Si verificano anche infezioni virali da papilloma virus. L’autoimmunità, l’allergia e i livelli elevati di IgE possono anche verificarsi. A causa di questo spettro di fenotipi clinici è importante considerare la diagnosi di ADA-deficienza negli individui più anziani, in quanto il ritardo nel riconoscimento porta al deterioramento della funzione immunologica e lo sviluppo di sequele irreversibili di infezioni ricorrenti e croniche. Lo screening ha anche identificato individui asintomatici che hanno un’attività ADA molto bassa o assente negli eritrociti, ma livelli maggiori di attività ADA (2%-50% del normale) nelle cellule nucleate, la cosiddetta “parziale ADA-deficienza”. Questi pazienti hanno una funzione immunitaria apparentemente normale e un’aspettativa di vita, anche se i dati di follow-up a lungo termine non sono attualmente disponibili per confermarlo.
Gestione
A differenza di altre forme di SCID, la gestione del deficit di ADA comprende diverse opzioni; ERT, HSCT allogenico e GT autologo, di cui solo gli ultimi due sono curativi.
ERT con adenosina deaminasi coniugata con polietilenglicole (PEG-ADA) è l’unica opzione terapeutica che non è definitiva in termini di correzione della malattia, ma permette la clearance sistemica o “disintossicazione” dei substrati metabolici tossici. La ERT è un’opzione se non c’è un donatore HSCT adatto, o se ci sono controindicazioni all’HSCT, tuttavia, la ERT a lungo termine è associata a una ricostituzione immunitaria sub-ottimale. Altre limitazioni della ERT includono la mancanza di disponibilità in alcuni paesi, il costo elevato e il fatto che il trattamento è necessario per tutta la vita. E’ anche un’opzione a breve termine utilizzata come ponte stabilizzante verso l’HSCT o la GT per migliorare la funzione immunitaria endogena e aiutare il recupero dalle infezioni o in caso di proteinosi alveolare polmonare per ottimizzare le condizioni cliniche prima della terapia definitiva. L’uso della ERT e i tempi di cessazione prima di un HSCT allogenico devono essere attentamente considerati, poiché il miglioramento dell’immunità del ricevente comporta un rischio potenzialmente maggiore di rigetto dell’innesto, ma la cessazione della ERT sottopone il paziente a un rischio significativamente maggiore di infezione. È interessante notare che Hassan et al. non hanno mostrato alcuna differenza nel risultato di sopravvivenza tra i pazienti che hanno e non hanno ricevuto ERT ≥ 3 mesi prima del HSCT, ma la maggior parte del gruppo che ha ricevuto ERT ha proceduto ad avere trapianti da donatore non apparentato/mismatched unrelated donor (MUD/MMUD) o da donatore aploidentico. L’ERT può essere continuato per un mese dopo il GT, o fino al momento dell’infusione, per mantenere bassi livelli di metaboliti tossici per facilitare l’incisione delle cellule corrette geneticamente.
Tradizionalmente, l’HSCT è stato il trattamento di scelta per ADA-deficiente SCID, di solito eseguito il più presto possibile dopo la diagnosi per ridurre al minimo il tempo esposto ad alti livelli di metaboliti tossici e prima dell’acquisizione di infezioni. Nel più grande studio fino ad oggi che ha esaminato l’esito di 106 pazienti con ADA-deficiente SCID dopo HSCT, HSCT più precoce è stato associato ad una migliore sopravvivenza complessiva, ma questo non ha raggiunto la significatività statistica, probabilmente a causa del minor numero di pazienti nei gruppi più anziani. Un risultato complessivo superiore è stato osservato a seguito di HSCT utilizzando donatori familiari e fratelli abbinati (MSD/MFD) rispetto a MUD e donatori aploidentici (86% e 81% contro 66% e 43% rispettivamente). Questo può essere correlato alla più rapida disponibilità di donatori fratelli o familiari, che probabilmente si traduce in una migliore condizione clinica per l’HSCT. Gli HSCT MSD e MFD sono anche solitamente eseguiti senza sieroterapia, con un impatto positivo sul tasso di recupero dei linfociti T e sull’eliminazione delle infezioni virali in questi pazienti. Il risultato è anche significativamente migliore nel HSCT non condizionato rispetto al condizionamento mieloablativo, anche se la mancanza di condizionamento può anche compromettere l’incisione, in particolare con donatori aploidentici. L’HSCT non condizionato utilizzando un MSD o MFD è associato a una ricostituzione immunitaria cellulare e umorale di successo, anche se l’esito a lungo termine dello stato immunitario non è noto ed è necessario un ulteriore follow-up. Questo è in contrasto con altre forme di SCID, e può essere che gli effetti tossici locali della carenza di ADA sul midollo agiscono come ‘auto-condizionamento’ e permettono l’incisione delle cellule staminali del donatore in assenza di chemioterapia. I pazienti che sopravvivono all’HSCT sembrano fare bene in termini di ricostituzione immunitaria, indipendentemente dal tipo di donatore utilizzato, con la maggior parte dei pazienti che raggiungono un recupero cellulare e umorale completo, sono in grado di dare risposte vaccinali e non richiedono la sostituzione di immunoglobuline. Al contrario, solo circa il 50% dei pazienti con ERT a lungo termine sono in grado di interrompere la terapia di sostituzione delle immunoglobuline.
Meno del 25% dei pazienti con ADA-deficiente SCID hanno un MSD o MFD disponibile, e in tali situazioni la GT è diventata un’opzione terapeutica accettata. Dopo lo sviluppo iniziale più di 20 anni fa, il GT per ADA-deficiente SCID è diventato una pietra miliare nel progresso medico come il primo GT (Strimvelis™) vettore retrovirale ex vivo con licenza dell’Unione Europea (UE). Gli approcci iniziali, prima dello sviluppo di Strimvelis™, utilizzavano il midollo osseo o il sangue del cordone ombelicale senza condizionamento preparatorio, ma risultavano in una produzione inadeguata di ADA e i pazienti richiedevano una ERT continua. Il miglioramento dei metodi di trasferimento genico e l’introduzione del condizionamento non mieloablativo con busulfano a basso dosaggio prima dell’infusione per fare spazio alle cellule trasfettate ha portato ad un’efficace ricostituzione immunitaria e, ad oggi, nessuna segnalazione di mutagenesi genotossica inserzionale, in contraddizione con altre immunodeficienze primarie trattate con terapia genica utilizzando vettori retrovirali. Il più grande rapporto fino ad oggi da Cicalese et al. di 18 pazienti ADA-SCID trattati con GT, con un follow-up mediano di 6,9 anni, ha riportato il 100% di sopravvivenza senza trasformazioni leucemiche, ridotto tasso di infezioni e robusta ricostituzione dei linfociti T e successivamente dei linfociti B, anche se la percentuale di cellule mieloidi corrette geneticamente era molto più bassa. I vantaggi del GT includono l’assenza di rischio di graft-versus-host disease, e l’inizio più rapido della terapia rispetto a quello che comporta la ricerca di un donatore quando un MSD o MFD non è disponibile. Tuttavia, il risultato a lungo termine non è ancora noto ed è necessario un ulteriore monitoraggio per consentire una migliore comprensione dei rischi associati alla GT rispetto all’HSCT allogenico o alla ERT a lungo termine. Anche se la GT con vettori gamma-retrovirali ha dimostrato un eccellente profilo di sicurezza fino ad oggi, sono stati recentemente riportati nuovi sviluppi che utilizzano la GT mediata da vettori lentivirali, che sfruttano il potenziale di trasdurre sia le cellule non in divisione che quelle in divisione, e che mostrano risultati promettenti sia in termini di efficacia clinica che di sicurezza.
Successo a lungo termine
Il trapianto con un MSD o MFD senza condizionamento subito dopo la diagnosi è associato a un buon risultato in termini di sopravvivenza e recupero dei CD3+ nel primo anno dopo l’HSCT, ma si sa poco sul risultato a lungo termine e sulla qualità della ricostituzione immunitaria dei pazienti con ADA-deficiente SCID. L’applicazione estesa dello screening neonatale per la SCID può contribuire a migliorare gli esiti anche in futuro, consentendo l’identificazione dei neonati con SCID (di tutte le cause genetiche) prima dello sviluppo di infezioni e altre complicazioni utilizzando la rilevazione di cerchi di escissione dei recettori delle cellule T (TRECs). I TREC sono pezzi di DNA escissi durante lo sviluppo del recettore delle cellule T, e sono una misura accurata della produzione timica. I pazienti con SCID hanno un numero significativamente diminuito di TRECs che possono essere rilevati utilizzando la macchia di sangue secco del neonato. Una diagnosi più precoce e un carico ridotto di complicazioni permette un intervento più tempestivo e un risultato migliore, come gli studi indicano che i fratelli diagnosticati sulla base di una storia familiare nota hanno una sopravvivenza significativamente migliore. Nonostante le prospettive positive in termini di ricostituzione immunitaria a seguito di HSCT come riportato da Hassan et al., il periodo di follow-up in questo studio è stato al massimo di 27,6 anni (mediana 6,5 anni), e sono necessari dati di follow-up più lunghi per continuare a valutare la permanenza dell’immunità dei linfociti T, in quanto i dati iniziali suggeriscono che la timopoiesi è limitata in MFD/MSD HSCT incondizionati, che può portare ad un eventuale esaurimento del repertorio di linfociti T. Le prospettive del GT come opzione terapeutica sono anche promettenti, in particolare con lo sviluppo di vettori raffinati e della tecnologia di editing genico, ma è necessario un ulteriore monitoraggio di follow-up a lungo termine. Lo sviluppo è in corso anche nel miglioramento del PEG-ADA, con una sperimentazione clinica in corso che utilizza un enzima ricombinante come alternativa alle sequenze bovine attualmente utilizzate. Anche se non sono stati eseguiti grandi studi prospettici che esaminano l’esito dei difetti non immunologici dopo il trattamento definitivo, piccoli rapporti retrospettivi suggeriscono che i difetti neurologici, comportamentali e audiologici non vengono corretti. Sono necessari ulteriori studi per esaminare se fattori come il tipo di donatore e il regime di condizionamento, o il tipo di terapia, influenzano i risultati in queste aree. È necessaria anche un’ulteriore comprensione della patogenesi sottostante coinvolta nelle manifestazioni sistemiche non immunitarie per consentire un’indagine e una gestione ottimali, nonché per decifrare completamente tra gli effetti metabolici della carenza di ADA e gli effetti inflitti da agenti infettivi.