Come funziona la cromatografia a scambio ionico?

La cromatografia a scambio ionico (IEX) è una tecnica comunemente usata nella purificazione delle biomolecole. Comporta la separazione delle molecole sulla base della loro carica.

Questa tecnica sfrutta l’interazione tra le molecole cariche in un campione e le moieties caricate in modo opposto nella fase stazionaria della matrice cromatografica. Questo tipo di separazione è difficile utilizzando altre tecniche poiché la carica è facilmente manipolata dal pH del tampone utilizzato.

Sono possibili due tipi di separazione a scambio ionico – scambio cationico e scambio anionico. Nello scambio anionico la fase stazionaria è caricata positivamente mentre nello scambio cationico è caricata negativamente.

Principio della cromatografia a scambio ionico

La cromatografia Ix è usata nella separazione di biomolecole cariche. Il campione grezzo contenente molecole cariche viene usato come fase liquida. Quando passa attraverso la colonna cromatografica, le molecole si legano a siti di carica opposta nella fase stazionaria.

Le molecole separate in base alla loro carica vengono eluite utilizzando una soluzione di forza ionica variabile. Facendo passare tale soluzione attraverso la colonna, avviene una separazione altamente selettiva delle molecole in base alle loro diverse cariche.

La tecnica

Le fasi principali della procedura di cromatografia a scambio ionico sono elencate di seguito:

• Un campione proteico impuro viene caricato nella colonna di cromatografia a scambio ionico a un pH particolare.
• Le proteine cariche si legheranno ai gruppi funzionali di carica opposta nella resina
• Per eluire le proteine separate viene utilizzato un gradiente salino. A basse concentrazioni di sale, le proteine che hanno pochi gruppi carichi vengono eluite e a concentrazioni di sale più alte, le proteine con diversi gruppi carichi vengono eluite.
• Le proteine indesiderate e le impurità vengono rimosse lavando la colonna.

Un gradiente di pH può anche essere applicato per eluire le singole proteine sulla base del loro punto isoelettrico (pI), cioè il punto in cui gli aminoacidi in una proteina hanno una carica neutra e quindi non migrano in un campo elettrico. Poiché gli amminoacidi sono composti ionici zwitter, contengono gruppi con cariche sia positive che negative. In base al pH dell’ambiente, le proteine hanno una carica positiva, negativa o nulla. Al loro punto isoelettrico, non interagiscono con le società cariche nella resina della colonna e quindi vengono eluite. Un gradiente di pH decrescente può essere utilizzato per eluire le proteine utilizzando una resina a scambio anionico e un gradiente di pH crescente può essere utilizzato per eluire le proteine dalle resine a scambio cationico. Questo perché l’aumento del pH del tampone della fase mobile fa sì che la proteina diventi meno protonata (meno carica positivamente) in modo che non possa formare un’interazione ionica con la resina carica negativamente, permettendo l’eluizione. Al contrario, abbassando il pH della fase mobile la molecola diventerà più protonata (meno caricata negativamente), permettendo la sua eluizione.

Selezione della resina nella cromatografia a scambio ionico

Le resine a scambio ionico hanno gruppi funzionali caricati positivamente o negativamente legati covalentemente a una matrice solida. Le matrici sono solitamente fatte di cellulosa, polistirene, agarosio e poliacrilammide. Alcuni dei fattori che influenzano la scelta della resina sono lo scambiatore anionico o cationico, la velocità di flusso, lo scambiatore di ioni debole o forte, la dimensione delle particelle della resina e la capacità di legame. La stabilità della proteina di interesse detta la selezione di uno scambiatore anionico o cationico – entrambi gli scambiatori possono essere usati se la stabilità non è preoccupante.

Le applicazioni della cromatografia a scambio ionico

Lo scambio ionico è il metodo cromatografico più usato per la separazione e purificazione di biomolecole cariche come polipeptidi, proteine, polinucleotidi e acidi nucleici. La sua ampia applicabilità, l’alta capacità e semplicità, e la sua alta risoluzione sono le ragioni chiave del suo successo come metodo di separazione. La cromatografia a scambio ionico è ampiamente utilizzata in diverse applicazioni industriali, alcune delle quali sono le seguenti:

• Separazione e purificazione di componenti del sangue come albumina, fattori di crescita ricombinanti ed enzimi.
• Biotecnologia – Applicazioni analitiche come il controllo di qualità e il monitoraggio dei processi
• Ricerca alimentare e clinica – per studiare le varietà di grano e la correlazione della proteinuria con diverse malattie renali.
• Fermentazione – Le resine a scambio cationico sono usate per monitorare il processo di fermentazione durante la produzione di ß-galattosidasi.

Altre letture

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• Panoramica della cromatografia
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• Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
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