Citrobacter freundii fitness durante l’infezione del flusso sanguigno

Raccolta di isolati di Citrobacter BSI

Rispetto ad altre specie Gram-negative che causano regolarmente BSI, sono disponibili poche informazioni sulla fisiologia di C. freundii nell’ambiente dell’ospite. Con l’obiettivo di affrontare questa lacuna, abbiamo prima raccolto otto isolati appartenenti al complesso C. freundii da pazienti con BSI all’interno dell’Università del Michigan Health System. La filogenesi basata sull’RNA ribosomiale è in grado di distinguere tre gruppi di specie di Citrobacter, di cui il gruppo I comprende almeno otto specie e include C. freundii23,24. Tuttavia, la sequenza 16S rRNA e gli approcci di identificazione basati sulla spettrometria di massa offrono una risoluzione filogenetica limitata all’interno di questo gruppo di specie Citrobacter. Pertanto, gli isolati utilizzati in questo studio sono stati ulteriormente valutati utilizzando un approccio di analisi di sequenza multilocus. Tra gli otto isolati raccolti, sei si sono raggruppati strettamente con i ceppi stabiliti di C. freundii (Fig. 1) e avevano un’identità nucleotidica media di >98% con il ceppo tipo ATCC 8090, che è superiore al cutoff tipicamente accettato del 95% per gli isolati della stessa specie. Dei due isolati rimanenti, UMH17 si raggruppava più strettamente con il ceppo tipo Citrobacter pasteurii CIP 55.13 e UMH18 con i ceppi Citrobacter werkmanii.

Batteriemia di C. freundii

Prima di studiare i requisiti di fitness di Citrobacter durante BSI, è stato sviluppato un modello murino di batteriemia basato su lavori precedenti con altre specie enteriche25. Tra gli isolati di Citrobacter BSI, i ceppi UMH14 e UMH15 sono stati scelti come candidati per questo studio. L’isolato UMH14 ha esibito una colonizzazione dose-dipendente più coerente della milza e del fegato a 24 ore dopo l’iniezione nella vena della coda (Fig. S1) ed è stato selezionato per ulteriori caratterizzazioni. Era anche necessario testare il modello di infezione per potenziali strozzature di colonizzazione prima di valutare il contributo dei singoli geni di C. freundii alla fitness utilizzando una vasta collezione di mutanti trasposoni. Un mutante spontaneo resistente all’acido nalidixico di UMH14 (UMH14Nal) è stato isolato e determinato per avere equivalente fitness in vitro durante la co-cultura con il ceppo padre in terreno ricco (Fig. S2). Per determinare se una popolazione diversificata di mutanti poteva essere stabilita nel flusso sanguigno senza perdita stocastica di singoli cloni, i ceppi UMH14Nal e UMH14 sono stati mescolati a diversi rapporti e inoculati nei topi. Dopo 24 ore, rapporti fino a 1:10.000 (UMH14Nal:UMH14) sono stati tollerati senza perdita spontanea del ceppo sottorappresentato nella milza (Fig. S2), indicando che un singolo topo potrebbe ospitare almeno 10.000 mutanti trasposoni unici ad una dose totale di 5 × 107 batteri utilizzando questo modello.

Per identificare i geni di fitness Citrobacter nel modello di batteriemia, cinque pool di mutanti di inserzione trasposone casuale che rappresentano >44.000 siti di inserzione unici sono stati iniettati nei topi e batteri che colonizzano la milza sono stati recuperati dopo 24 ore (Fig. S3). L’abbondanza relativa dei singoli mutanti transposon nell’inoculo e nelle uscite spleniche, come determinato da high-throughput sequencing, è stato utilizzato per identificare i geni che contribuiscono alla sopravvivenza batterica nel modello. Un totale di 177 transposon-disrupted geni conferito una significativa perdita di fitness e nove geni sono stati associati con una maggiore fitness batterica quando mutato (fold-change ≥ 2.0, Adj. P < 0.05) (Dati S1). Una seconda analisi con questo set di dati ha identificato 546 geni essenziali putativi codificati cromosomicamente per i quali il numero di letture nella popolazione di ingresso era significativamente inferiore a quello previsto in base ai siti TA disponibili e la dimensione della popolazione di libreria (logFC <-5.17) (dati S2). Utilizzando questo modello di infezione opportunistica e sistemica, è stato previsto che la maggior parte dei fattori di fitness identificati avrebbe rappresentato processi fisiologici di base piuttosto che fattori di virulenza prototipici (ad esempio, tossine proteiche o adesine). Infatti, la categorizzazione dei 177 geni associati a significativi difetti di fitness da parte di Clusters of Orthologous Groups (COG) rifletteva la predominanza di vie metaboliche e funzioni di manutenzione cellulare richieste durante la batteriemia di C. freundii (Fig. 2). Circa la metà dei geni di fitness identificati si adattano ampiamente a cinque categorie COG che comprendono la produzione di energia, il metabolismo degli aminoacidi, la replicazione e la riparazione del DNA, la traduzione, la parete cellulare e la biogenesi della membrana. Le sequenze di amminoacidi dei fattori di fitness della batteriemia che soddisfano i criteri di significatività sono state analizzate per la distribuzione COG. Le classi COG non mostrate non contenevano proteine rappresentative tra i 177 fattori di fitness. Ventidue fattori di fitness non sono stati categorizzati con questo metodo.

Validazione dei mutanti dei singoli geni di fitness

Il contributo dei singoli prodotti genici al fitness di C. freundii è stato confermato con mutazioni di delezione-inserzione indipendenti costruite in geni UMH14 selezionati (Tabella 1). Tutti i ceppi ingegnerizzati qui riportati mancavano di difetti lordi di replicazione come determinato dalla crescita in terreno ricco (Fig. S4). Per ogni gene elencato nella Tabella 1, la fitness è stata misurata co-infettando i singoli mutanti con il ceppo genitore UMH14. Cinque dei sette mutanti inizialmente testati hanno mostrato uno svantaggio competitivo statisticamente significativo nella milza o nel fegato (Fig. 3A), affermando così i risultati dello screening del trasposone. Il mutante znuB è stato selezionato come un controllo negativo per la convalida qui poiché i risultati dello schermo trasposone indicato che nessun difetto di fitness è stato associato a questo gene, nonostante le prove da altre specie batteriche che dimostrano il contributo del sistema di trasporto zinco ZnuABC per l’infezione murina 26,27,28. In competizione con UMH14, il mutante znuB non è riuscito a mostrare un difetto significativo di fitness, in accordo con i risultati attesi. L’adiacente znuA (fold-change = 1.5, Adj. P = 0.527) e znuC (fold-change = 2.0, Adj. P = 0.035) geni UMH14 anche conferito o nessun difetto di fitness o un difetto minimo quando mutato da inserimento trasposone (dati S1).

La mutazione del gene tatC, che codifica un componente del sistema di traslocazione dell’arginina gemella, ha provocato la maggiore perdita di fitness tra tutti i mutanti testati (Fig. 3). Per determinare se la ridotta fitness di questo mutante potrebbe essere ripristinata attraverso la complementazione genetica, il plasmide pBBR1MCS-5 che porta il frame di lettura aperta tatC è stato introdotto nel mutante tatC e la fitness relativa del ceppo risultante è stata testata. Il mutante tatC ha inizialmente mostrato un difetto di fitness di 67 volte nella milza in competizione con il ceppo wild-type (Fig. 3A), mentre il mutante tatC complementato ha mostrato solo un difetto di fitness di due volte nelle stesse condizioni (Fig. 3B). Allo stesso modo, il mutante tatC complementato non era significativamente fuori competizione nel fegato rispetto a UMH14. Il plasmide pBBR1MCS-5 genitore è noto per essere stabilmente mantenuto durante l’infezione in assenza di selezione29 e la cultura in vitro del C. freundii tatC mutante harboring o pBBR1MCS-5 o il plasmide complementazione tatC + dimostrato alcuna perdita apprezzabile di plasmide oltre 24 ore in assenza di selezione (Fig. S5). Insieme, questi risultati stabiliscono fermamente il requisito della funzione TatC durante la batteriemia di Citrobacter.

Conservazione dei geni di fitness tra gli isolati di Citrobacter

Nel corso di questo studio, è stata determinata la sequenza completa del genoma di ogni isolato di Citrobacter e il proteoma previsto di ogni ceppo è stato confrontato con UMH14 come riferimento. Dei 4.666 prodotti genici previsti codificati sul cromosoma UMH14, 3.742 sono conservati con un’identità ≥95% tra tutti gli isolati di C. freundii in questo studio (Fig. 4A). Il numero di proteine conservate (identità ≥95%) tra tutti i ceppi diminuisce a 2.545 quando i proteomi predetti di UMH17 e UMH18 sono stati inclusi, coerentemente con il posizionamento di questi isolati al di fuori del ramo C. freundii da analisi di sequenza multilocus (Fig. 1). La conservazione dei fattori di fitness UMH14 era anche alta, con 145 delle 177 proteine previste conservate a ≥95% di identità aminoacidica tra gli otto ceppi di batteriemia (Fig. 4B), compresi tutti e sette i fattori di fitness iniziale che sono stati selezionati per la convalida (Tabella 1 e Fig. 3). Rimuovendo UMH17 e UMH18 dalla considerazione è aumentato il numero di fattori di fitness conservati a 162 (92%). Questi risultati suggeriscono una strategia di sopravvivenza di Citrobacter durante la batteriemia che dipende in gran parte da proteine conservate all’interno della specie. È interessante notare che pochi fattori di fitness erano completamente unici (<30% di identità) per UMH14 in questo sottoinsieme di ceppi. Un esempio notevole è un operone putativo a tre geni (CUC46_23440-CUC46_23450) con difetti di fitness osservati che vanno da 6 a 14 volte. Tutti e tre gli open reading frame codificano proteine ipotetiche e tra queste solo CUC46_23450 è previsto codificare un dominio conservato con una funzione assegnata (cd01713, fosfoadenosina fosfosolfato reduttasi).

Percorsi di ricombinazione e riparazione del DNA

Uno degli obiettivi di questo studio era quello di identificare i percorsi biologici conservati che coinvolgono più fattori di fitness della batteriemia. I complessi enzimatici RecBCD e RuvABC che sono coinvolti nella ricombinazione e riparazione del DNA rappresentano un esempio. L’enzima RecBCD è attivo sulle estremità del DNA duplex ed è richiesto per i processi di ricombinazione omologa e di riparazione del DNA ricombinante. In relazione a queste funzioni, l’enzima RuvABC facilita la migrazione e la risoluzione della giunzione di Holliday30,31. L’inserimento del trasposone in recB, recC o recD ha portato a una riduzione di 6-8 volte della forma fisica e, analogamente, l’interruzione di ruvA e ruvC mediante inserimento del trasposone ha portato a una perdita di forma fisica >30 volte (dati S1). È importante notare che il difetto di fitness di ruvA è stato confermato dall’infezione da competizione contro il ceppo wild-type usando un mutante costruito indipendentemente (Fig. 3A). All’interno dei due complessi multi-proteici, solo RuvB non è stato identificato come un fattore significativo di fitness nel nostro set di dati. Entrambi i complessi proteici sono noti per partecipare alla risoluzione di forchette di replicazione del DNA in stallo o collassato che si verificano durante la normale sintesi cromosomica 30, anche se è importante, il mutante ruvA cresciuto in modo simile al ceppo wild-type durante la replicazione rapida in mezzo ricco (Fig. S4). Si è tentati di ipotizzare che il danno al DNA batterico che si verifica nell’ambiente ospite, potenzialmente attraverso la produzione mediata dalle cellule immunitarie di specie reattive dell’ossigeno, possa anche contribuire alla richiesta di questi complessi.

Il sistema di traslocazione gemello-arginina

Il sistema di traslocazione gemello-arginina funziona nelle specie batteriche Gram-negative per secernere proteine piegate attraverso la membrana citoplasmatica. Il ruolo di TatC in questo sistema multiproteico conservato è nel riconoscimento delle sequenze di segnale di secrezione per le proteine che vengono esportate attraverso questa via. Avendo stabilito il significativo impatto del gene TatC sulla fitness in vivo di C. freundii (Fig. 3), si è pensato che anche le proteine secrete dal sistema Tat possano essere necessarie per la fitness nel modello murino. Per identificare le proteine putative secrete da Tat, la sequenza N-terminale di ciascuno dei 177 fattori di fitness è stata analizzata utilizzando il software di predizione TatP 1.032. Due geni, CUC46_16565 e CUC46_16060, sono stati identificati come codificanti peptidi di segnale Tat-dipendenti contenenti motivi a doppia arginina. Il prodotto CUC46_16565 condivide il 94% di identità aminoacidica con la proteina SufI di E. coli, compresa la conservazione del 100% del motivo della doppia arginina e della porzione idrofoba del peptide di segnale33. Il gene C. freundii sufI è stato mutato e fitness è stato valutato in concorrenza con il ceppo genitore UMH14 per determinare se qualsiasi del difetto fitness associato con la perdita di TatC potrebbe essere attribuito alla rottura della funzione SufI (Fig. 5A). Infatti, il ceppo mutante SufI è stato superato di 7 volte nella milza e di 17 volte nel fegato rispetto al ceppo wild-type. Tuttavia, poiché il costo di fitness della mutazione tatC variava da 67 volte a 112 volte in competizione con i batteri wild-type (Fig. 3), il costo di fitness relativamente basso della mutazione sufI implica che anche altri substrati Tat-dipendenti possono contribuire al fitness. I tentativi di stabilire la secrezione Tat-dipendente di SufI in C. freundii non hanno avuto successo a causa di evidenti problemi di tossicità associati all’espressione di un costrutto C-terminale FLAG epitiope-tagged SufI, in particolare nel ceppo mutante tatC (dati non mostrati). Tuttavia, SufI è stata utilizzata come proteina modello secreta da Tat in numerosi studi di caratterizzazione del sistema Tat di E. coli.

Il secondo potenziale fattore di fitness secreto da Tat che è stato identificato, codificato da CUC496_16060, è una predetta prolina aminopeptidasi (PRK10879) appartenente alla superfamiglia PepP. Un ceppo mutante privo del gene pepP è stato superato di circa 3 volte nella milza e di circa 2 volte nel fegato, ma lo svantaggio di fitness osservato rispetto al wild-type non era statisticamente significativo (Fig. 5A). Tuttavia, la localizzazione subcellulare di PepP è stata determinata utilizzando un derivato epitopo-taggato C-terminale FLAG trasportato su un plasmide multi-copia (PepPFLAG). Livelli inaspettatamente bassi di PepPFLAG sono stati rilevati nel mutante tatC rispetto a UMH14; tuttavia, la proteina di fusione PepPFLAG è stata trovata principalmente nella frazione citoplasmatica di entrambi i ceppi testati (Fig. S6) e non è stata ottenuta alcuna prova della localizzazione subcellulare Tat-dipendente della proteina PepP. Insieme ai risultati dell’infezione da competizione del mutante sufI, questi dati supportano ulteriormente la nozione che in C. freundii siano presenti ulteriori fattori di fitness Tat-dipendenti o che la perdita cumulativa della traslocazione della proteina attraverso il sistema Tat superi la perdita di funzione per ogni singolo substrato.

Uno dei fenotipi prevalenti associati ai mutanti tat con perdita di funzione in tutte le specie è una compromissione della motilità34,35,36,37. C. freundii è un batterio flagellato in grado di nuotare motilità in una matrice di agar morbido. Il C. freundii tatC mutante esibito una riduzione di circa 2 volte in motilità nuoto rispetto al ceppo wild-type e nuoto motilità è stato completamente ripristinato dalla complementazione genetica in trans (Fig. 5B, C). Questi risultati dimostrano chiaramente un difetto di motilità in assenza della funzione di TatC; tuttavia, poiché il nuoto a basso livello è stato ancora osservato nel mutante tatC, è probabile che venga mantenuta una certa funzione flagellare. Con l’eccezione di fliQ, la generale mancanza di geni di fitness associati alla flagella identificati durante la batteriemia suggerisce che l’importanza di tatC per la fitness di C. freundii può essere largamente indipendente dalla disfunzione della flagella osservata in questo ceppo.

Percorsi metabolici di fitness

Come notato in precedenza, una parte considerevole dei geni di fitness di Citrobacter identificati sono stati previsti per funzionare in percorsi metabolici (Fig. 2). Tre diversi geni che rappresentano i componenti del metabolismo del carbonio centrale (pfkA), il metabolismo del fruttosio e mannosio (mtlD) e la biosintesi degli aminoacidi (cysE) sono stati scelti per ulteriori indagini. La biosintesi batterica della cisteina avviene dalla L-serina attraverso l’intermedio O-acetil-L-serina (OAS). Questo primo passo nel percorso modello di E. coli è catalizzato dall’enzima CysE O-acetiltransferasi e la perdita di cysE risulta in un’auxotrofia di cisteina38,39. Un C. freundii cysE mutante è allo stesso modo in grado di replicare in mezzo definito privo di cisteina (Fig. 6A), ma può raggiungere densità quasi di tipo selvatico quando il mezzo è stato integrato con OAS (Fig. 6B) o cisteina (Fig. 6C). La complementazione genetica della mutazione cysE ha portato al parziale ripristino della crescita in assenza di cisteina. È interessante notare che la completa mancanza di crescita per i batteri mutanti cysE in assenza di OAS o cisteina in vitro è in contrasto con il difetto di fitness parziale osservato durante l’infezione (Fig. 3A). Questo suggerisce che Citrobacter può essere in grado di ottenere questi metaboliti dall’ambiente del flusso sanguigno, ma c’è ancora un costo di fitness associato all’interruzione della via biosintetica.

Come parte della nostra indagine sul metabolismo associato all’ospite di Citrobacter, la capacità di questo batterio di utilizzare diverse fonti di carbonio è stata studiata. L’enzima fosfofruttochinasi PfkA di altre specie enteriche è stato ampiamente caratterizzato e rappresenta il primo passo impegnato nella glicolisi, catalizzando la fosforilazione del fruttosio-6-fosfato in fruttosio-1,6-bisfosfato. Per UMH14, la mutazione di pfkA ha eliminato la capacità di questo ceppo di replicare su glucosio come unica fonte di carbonio (Fig. 6D), che potrebbe essere parzialmente ripristinata fornendo pfkA su un plasmide multicopia. Questa perdita totale di utilizzo del glucosio in vitro è correlata a una diminuzione di due volte della fitness durante la batteriemia (Fig. 3A). Poiché il glucosio è una fonte di carbonio abbondante nel siero dei mammiferi40, questi risultati sono coerenti con un ruolo per l’utilizzo di Citrobacter di glucosio durante l’infezione, ma suggeriscono anche che il repertorio metabolico di Citrobacter può facilitare l’utilizzo di fonti alternative di carbonio ed energia.

Una seconda attività enzimatica che coinvolge fruttosio-6-fosfato è stata anche studiata per i contributi alla batteriemia Citrobacter. La proteina mannitolo-1-fosfato-5-deidrogenasi, MtlD, facilita la conversione bidirezionale di mannitolo-1-fosfato e fruttosio-6-fosfato usando NAD+ o NADH come cofattore41,42. Molte specie batteriche enteriche possono utilizzare il mannitolo come unica fonte di carbonio dopo il trasporto attraverso un sistema di fosfoenolpiruvato-fosfotransferasi dipendente dall’esitolo, con conseguente accumulo intracellulare di mannitolo-1-fosfato43,44. Un possibile destino del mannitolo-1-fosfato è l’ossidazione MtlD-dipendente a fruttosio-6-fosfato e il successivo incanalamento nella via glicolitica. Il mutante mtlD di C. freundii ha mostrato una diminuzione di cinque volte in fitness nel fegato murino (Fig. 3A) e questa osservazione ha spinto gli esperimenti per determinare se C. freundii era capace di questo tipo di metabolismo in vitro. I ceppi derivati UMH14 e mtlD sono stati coltivati in un terreno definito contenente mannitolo e le curve di crescita risultanti dimostrano che i batteri wild-type e il mutante complementare sono stati in grado di proliferare in queste condizioni, mentre il ceppo mtlD non poteva (Fig. 6E). Come previsto, il mutante mtlD è stato in grado di replicare a livelli quasi selvatici quando gli è stato fornito il glucosio come fonte di carbonio in condizioni aerobiche (Fig. 6F). Insieme questi risultati stabiliscono sia la capacità di C. freundii di utilizzare il mannitolo come unica fonte di carbonio e il requisito per mtlD in questo processo.

Strategie di fitness condivise tra patogeni nell’ambiente del flusso sanguigno

Abbiamo precedentemente valutato i requisiti di fitness di un altro patogeno opportunista, S. marcescens, utilizzando un modello murino simile di batteriemia. I risultati dello studio di S. marcescens includevano l’identificazione di 212 geni di fitness utilizzando tecniche simili al presente lavoro45. Nel tentativo di determinare se queste specie condividono qualsiasi percorso comune per il fitness durante BSI, i proteomi previsti di entrambe le specie sono stati prima confrontati. Le proteine sono state considerate omologhe tra C. freundii e S. marcescens se hanno condiviso ≥70% di identità aminoacidica su ≥50% della sequenza. In totale, 42 proteine omologhe sono state identificate come fattori di fitness significativi in entrambi gli organismi (Tabella S1) con un certo numero di funzioni diverse sono rappresentate in questo elenco di fattori di fitness condivisi. In particolare, la proteina RuvA, la cui perdita ha portato a una diminuzione >10 volte in C. freundii fitness da infezione concorrenza (Fig. 3A), è stato identificato insieme a RuvC come fattori di fitness in S. marcescens. Questi risultati supportano ulteriormente l’ipotesi che la risoluzione dei complessi di giunzione Holliday, potenzialmente durante la riparazione ricombinazionale del danno al DNA, è importante per la fitness in vivo di questi organismi. L’enzima fosfofruttochinasi PfkA è stato anche identificato come un fattore di fitness in entrambe le specie. Come osservato con Citrobacter, S. marcescens pfkA è richiesto per l’utilizzo di glucosio come unica fonte di carbonio, ed è stato ulteriormente richiesto per la replicazione batterica ottimale nel siero umano inattivato dal calore45. In entrambi gli organismi, pfkA ha contribuito a fitness nella milza come valutato dallo schermo transposon, anche se è interessante, il mutante S. marcescens pfkA anche esibito ca. 9 volte ridotto fitness nel rene da infezione concorrenza con il ceppo wild-type. Nel corso di questo lavoro, è stato osservato che C. freundii UMH14 ceppo wild-type esibito relativamente scarsa colonizzazione del rene nel modello BSI, ma il gene pfkA di Proteus mirabilis ha dimostrato di contribuire alla fitness nel rene dopo infezione del tratto urinario46. Insieme questi risultati dimostrano la fattibilità di identificare strategie di fitness conservate tra gli organismi all’interno di un ambiente specifico. Sarà necessario un ulteriore lavoro per determinare se questi prodotti genici sono richiesti anche in altri organismi che causano BSI e se questi percorsi di fitness conservati possono essere sfruttati.