Faccio parte di un gruppo di interesse di ematologia e mi piace sempre vedere i casi di studio e le domande che gli altri tecnici pubblicano. Questo gruppo è multinazionale, quindi vedo post da tecnici di tutto il mondo. È interessante vedere le somiglianze e le differenze nelle pratiche operative standard e i ruoli che i tecnici svolgono in diverse aree e in diversi paesi. È anche interessante vedere che ci imbattiamo tutti negli stessi tipi di problemi e di campioni difficili! Negli ultimi mesi in questo gruppo di interesse di ematologia, ho visto molte domande e commenti sulla risoluzione delle piastrine agglomerate, e quindi sto usando questa opportunità per far luce su questi campioni difficili. Il caso che presento, e le foto, sono per gentile concessione di Abu Jad Caesar, che è un responsabile di laboratorio presso Medicare Laboratories – filiale di Tulkarm, in Palestina.
Il paziente aveva un CBC eseguito su un Nihon Kohden 6410. I globuli bianchi erano 12,7 x 103μL, la conta delle piastrine per impedenza era di 20.000/μL sulla corsa iniziale, altri parametri apparivano entro i limiti normali. Il campione è stato riscaldato ed è stata richiesta una provetta di Na Citrato per escludere la pseudotrombocitopenia. Dopo il riscaldamento, l’EDTA è stato rifatto con una conta piastrinica di 0/μL. La provetta di Na Citrate è stata eseguita, e la conta delle piastrine dallo strumento era di 189.000/μL. (Figura 1) A causa del sangue: rapporto anticoagulante nella provetta Na Citrate, è stato applicato un moltiplicatore di 1,1, rendendo così la conta delle piastrine Na Citrate 207.900/μL. I vetrini sono stati fatti, colorati ed esaminati. L’immagine 1 mostra il raggruppamento nella provetta EDTA. L’immagine 2 mostra lo striscio dalla provetta di Na Citratetube, senza clumping visivo.
L’emocromo è stato segnalato con i seguenti commenti: Si è osservato un raggruppamento di piastrine, 2 campioni prelevati per escludere la trombocitopenia. Lo striscio di sangue intero EDTA aveva molti grumi di piastrine notati (trombocitopenia indotta da EDTA). Conclusione: Le piastrine sono adeguate e stimate a circa 200.000/μL.
Il conteggio delle piastrine nel range di normalità di solito non ci dà molti problemi nel riferire, anche se è presente qualche raggruppamento, principalmente perché sono normali. Una conta piastrinica adeguata rientra in un tipico rangeof di riferimento di circa 150- 450 x 103/μL.Se ci sono bandiere strumento per un scattergram piastrinico anormale o plateletclumps, si raccomanda di ripetere il test con un altro metodo. Se il conteggio iniziale viene eseguito tramite conteggio dell’impedenza, molti analizzatori possono anche riportare conteggi di piastrine ottiche o fluorescenti. Con il conteggio per impedenza, i globuli rossi molto piccoli o i frammenti possono essere contati come piastrine, dando così un conteggio falsamente aumentato delle piastrine. Con il conteggio ottico, le piastrine grandi possono essere contate come RBC, dando così un conteggio falsamente diminuito. Alcuni analizzatori ematologici Sysmex utilizzano conteggio ottico e a impedenza e dispongono anche di conteggio piastrinico fluorescente che utilizza un colorante specifico per le piastrine e fornisce un conteggio piastrinico accurato senza le interferenze di altri metodi. Una conta piastrinica normale, anche con la formazione di coaguli, è ancora di solito stimata come normale (o può occasionalmente essere aumentata).
Trombocitopenia, d’altra parte, può essere una sfida nel laboratorio ematologico. Con la trombocitopenia, i medici hanno bisogno di un conteggio accurato per diagnosticare, trattare o monitorare i pazienti. Anche un piccolo aumento o diminuzione può essere significativo quando c’è una grave trombocitopenia. Con meno piastrine, ogni piastrina conta!
Una delle prime domande che dobbiamo fare con un’apparente trombocitopenia è se si tratta di una vera trombocitopenia o se è una pseudotrombocitopenia (PTCP). Una vera trombocitopenia rappresenta un paziente con una bassa conta piastrinica che può avere bisogno di monitoraggio o di un intervento medico. Può essere pericoloso sbagliare la trombocitopenia, ma è anche pericoloso segnalare una bassa conta piastrinica in un paziente con una trombocitopenia spuria che non è effettivamente trombocitopenico. La pseudotrombocitopenia, o trombocitopenia spuria, è definita come una conta piastrinica artificialmente o erroneamente bassa. Nella PTCP, la bassa conta piastrinica è dovuta a grumi che vengono contati come 1 piastrina. (Questi grandi grumi possono anche essere contati come WBC, dando così un conteggio WBC falsamente aumentato).
Possiamo dividere il PTCP in 2 categorie Il clumping delle piastrine è più comunemente causato da errori pre-analitici come provette EDTA troppo piene o sotto-piene, campioni coagulati o un ritardo tra la raccolta del campione e il test. I tecnici dovrebbero controllare la provetta per i coaguli e il volume del campione e fare un controllo delta per aiutare a differenziare la trombocitopenia e la PTCP. Ma, con un apparente ‘buon’ campione, il passo successivo sarebbe una revisione dello striscio. Se ci sono grumi visti sullo striscio, allora dobbiamo decidere cosa ha causato i grumi. È la prima categoria, uno di questi comuni problemi pre-analitici, o è il 2ndcategory di PTCP, un’agglutinazione in vitro delle piastrine? Le condizioni che possono causare questa agglutinazione in vitro delle piastrine includono agglutinine a freddo, mieloma multiplo, infezioni, anticorpi anticardiolipina, alti livelli di immunoglobuline, terapia con abciximab e pseudotrombocitopenia indotta da EDTA. (EDTA-PTCP) Tra queste, la pseudotrombocitopenia indotta da EDTA è la causa più comune. (Nakashima,2016).
Quando i tecnici parlano di problemi di grumi di piastrine, di solito è perché stiamo cercando un modo per risolvere o stimare accuratamente la conta delle piastrine in questi campioni, e non sembra esserci una risposta facile. Come possiamo stimare questi conteggi? Segnaliamo semplicemente la presenza di clumping con “appare normale”, “diminuito” o “aumentato”? Oppure, dovremmo dividere le nostre stime in più intervalli per dare ai medici informazioni più preziose? E cosa succede se il fornitore vuole un conteggio effettivo per dare al paziente la migliore cura possibile e non possiamo risolvere il clumping? Cosa possiamo fare per fornire un conteggio? Alcuni dei primi passi raccomandati includono il vortice del campione per 2 minuti per rompere i grumi di piastrine, quindi la ri-analisi. Riscaldare i campioni può anche aiutare a risolvere i grumi di piastrine, in particolare nei campioni con agglutinine fredde o che hanno avuto un ritardo nel test e sono stati trasportati o conservati a temperatura ambiente o inferiore. Se i grumi persistono e il ritiro del campione produce ancora grumi piastrinici, allora l’errore preanalitico può essere escluso e si può sospettare una pseudotrombocitopenia indotta da EDTA. Molti laboratori faranno prelevare una provetta alternativa o useranno un altro metodo per aiutare a risolvere il clumping.
Quindi, cos’è la trombocitopenia indotta da EDTA (EDTA-PTCP)? Questo non è rappresentativo di un quadro clinico particolare e non è diagnostico per nessun disturbo o terapia farmacologica, ma è un fenomeno di laboratorio dovuto alla presenza di autoanticorpi IgM/IgG dipendenti dall’EDTA. L’EDTA induce e migliora questo legame esponendo queste glicoproteine agli anticorpi.(Geok Chin Tan, 2016) Sebbene si tratti di un fenomeno in vitro, i pazienti con determinate condizioni, come neoplasie maligne, malattie epatiche croniche, infezioni, gravidanza e malattie autoimmuni, hanno un rischio maggiore di EDTA-PTCP. Tuttavia, l’EDTA-PTCP è stata osservata anche in pazienti che non presentano malattie. (Zhang, 2018)
Quali sono alcuni metodi alternativi per aiutare a risolvere i problemi di aggregazione piastrinica indotti dall’EDTA? Probabilmente il più comune è quello di prelevare nuovamente il campione in una provetta di Na Citrato. Dovrebbero essere prelevate entrambe le provette con EDTA e Na Citrato. In un vero EDTA-PTCP, come visto nel nostro caso di studio, si dovrebbero vedere grumi sullo striscio fatto dalla provetta di EDTA e nessun grumo sullo striscio fatto dalla provetta di Na Citrato. A causa del volume dell’anticoagulante nella provetta di Na Citrate è necessario applicare anche il fattore di diluizione di 1.1 al conteggio dalla provetta di Na Citrate per ottenere una conta piastrinica accurata. Si noti, tuttavia, che gli analizzatori ematologici sono approvati dalla FDA e convalidati per l’uso con provette EDTA. Se si desidera utilizzare un diverso anticoagulante, il metodo deve essere convalidato nel proprio laboratorio. Si noti inoltre che i metodi alternativi generalmente risolvono solo EDTA -PTCP, e non il clumping dueto altre agglutinine fredde, farmaci o disturbi. Inoltre, la trombocitopenia indotta da anticoagulanti non è limitata all’EDTA. Può verificarsi anche con citrato ed eparina. In uno studio, è stato trovato che fino al 17% dei pazienti con un EDTA -PTCPal anche esibito questo fenomeno con citrato. Infatti, i ricercatori hanno trovato, e noi abbiamo trovato nelle nostre convalide, che alcuni campioni che non si aggregano in EDTA in realtà si aggregano in Na Citrato. Quindi, le provette alternative potrebbero non risolvere tutti i raggruppamenti di piastrine. (Geok Chin Tan, 2016)
Alcuni laboratori hanno convalidato le provette anticoagulanti ACD (acido citrico, citrato trisodico, destrosio) per EDTA-PTCP. Con questo metodo, le provette EDTA e ACD devono essere eseguite in parallelo e deve essere applicato un fattore di conversione che rifletta la differenza di diluizione del campione nelle 2 provette. Un parametro come l’RBC deve essere scelto per fare questo confronto. Utilizzando una formula che divide l’RBC in EDTA per l’RBC in ACD si ottiene un rapporto che riflette le differenze di diluizione tra gli anticoagulanti. Questo rapporto può poi essere moltiplicato per la conta delle piastrine ACD per ottenere la conta delle piastrine corretta per ACD. (CAP Today, 2014). Alcune fonti hanno raccomandato le provette ACD perché l’incidenza dell’aggregazione con NaCitrato può essere frustrante. Si teorizza che la provetta ACD più acida possa prevenire l’aggregazione delle piastrine meglio del citrato di Na. (Manthorpe, 1981)
Tubi meno comunemente usati sono CTAD (citrato trisodico, teofillina, adenosina, dipiridamolo) ed eparina. Il CTAD agisce direttamente sulle piastrine e inibisce il fattore 4 delle piastrine, minimizzando così l’attivazione piastrinica. Gli svantaggi delle provette CTAD sono che sono sensibili alla luce e devono essere conservate al buio, e possono essere costose. Inoltre alterano il rapporto di diluizione sangue/additivo socalculazioni deve essere utilizzato, come visto con Na citrato e ACD. Tubi di eparina sono meno comunemente trovato per essere utile nella risoluzione di clumping piastrine issuesbecause eparina può piastrine attive. I tubi di eparina sono anche più costosi, quindi non sono stati generalmente una prima scelta per EDTA-PTCP.
Ho sentito dire dai tecnici che i loro laboratori hanno ottimi risultati usando l’amikacina aggiunta alle provette EDTA per prevenire conteggi delle piastrine spuriamente bassi nei pazienti con EDTA-PTCP. L’amikacina dovrebbe essere aggiunta alla provetta EDTA entro 1 ora dal prelievo e il test è stabile fino a 4 ore a temperatura ambiente. I risultati di uno studio condotto nel 2011 hanno dimostrato che l’aggiunta di amikacina alla provetta EDTA ha prodotto una rapida dissociazione dei grumi piastrinici con poco o nessun effetto sulla morfologia o sugli indici. Questo metodo si è dimostrato molto promettente per riportare un’accurata conta delle piastrine nei pazienti con PTCP indotta da multianticoagulanti. (Zhou, 2011)
L’ultimo tubo anticoagulante che ho visto menzionato da molti tecnici nel gruppo di interesse di ematologia sono i tubi Sarstedt ThromboExact. Ho visto molti post da tecnici che usano questi e sembrano avere un tasso di successo molto buono. Le provette ThromboExact contengono sali di magnesio e sono specificamente progettate per determinare la conta delle piastrine nei casi di PTCP. Attualmente sono convalidate solo per la conta delle piastrine e i campioni sono stabili per 12 ore dopo la raccolta. È interessante notare che, prima degli analizzatori ematologici automatizzati, il magnesio era l’anticoagulante di scelta per la conta manuale delle piastrine. L’EDTA-PTCP è stato riconosciuto da quando i conteggi automatizzati delle piastrine con EDTA sono stati introdotti negli anni ’70. Uno studio del 2013 in Germania ha utilizzato le provette ThromboExact con risultati eccellenti per risolvere la PTCP indotta da più anticoagulanti. Queste provette sono diventate disponibili in commercio durante lo studio, nel 2013. (Schuff-Werner, 2013) Purtroppo per noi negli Stati Uniti, questi tubi non sono disponibili negli USA. Recentemente sono stato a una conferenza e sono andato dai rappresentanti di Sarstedt e ho chiesto di questi tubi. Mi è stato detto che sono disponibili in alcune parti dell’Europa e dell’Asia ma non sono approvati dalla FDA negli Stati Uniti. Ho chiesto con molta speranza se stavano cercando di ottenere l’approvazione della FDA e purtroppo mi è stato detto che “non pensavano di avere il mercato per loro di perseguire l’approvazione.”
Qualunque sia il metodo alternativo che il tuo laboratorio sceglie di utilizzare, è consigliato di disegnare un EDTA e la provetta alternativa insieme. In questo modo i 2 conteggi e la presenza o assenza di grumi nelle provette possono essere confrontati. Abbiamo molti pazienti che hanno avuto un’incidenza di clumping, ma quando il fornitore ordina un conteggio delle piastrine con Na Citrate, otteniamo un nuovo prelievo di entrambe le provette EDTA e Na Citrate insieme, e non c’è nessuna segnalazione o clumping visto con EDTA. In questi casi è opportuno dare come risultato i risultati dell’EDTA poiché non c’è evidenza di EDTA-PTCP.
Quando un paziente ha una bassa conta delle PLT senza alcuna malattia ematologica, storia familiare e/o tendenza al sanguinamento identificata, e gli errori preanalitici sono stati esclusi, la PTCP dovrebbe essere considerata. Questo non significa che un paziente con PTCP avrà una conta piastrinica normale dopo la risoluzione del clumping. Come detto sopra, molti pazienti con EDTA-PTCP hanno disturbi ematologici o di altro tipo e possono essere veramente trombocitopenici. Risolvere il clumping in questi pazienti ci permette di dare al fornitore una conta piastrinica accurata, che è molto importante nei pazienti trombocitopenici.
Il diagramma di flusso qui sotto (Figura 4) mostra alcune cose da considerare quando si ha a che fare con il raggruppamento delle piastrine. Il nostro obiettivo è quello di risolvere il clumping in modo da poter riportare una conta piastrinica accurata in modo tempestivo. Nel laboratorio dove lavoro, ho convalidato le provette di citrato di Na, ma queste sembrano risolvere il clumping in meno del 50% dei pazienti. Come ultima risorsa, per ottenere un conteggio accurato delle piastrine, alcuni articoli hanno suggerito di raccogliere un dito ed eseguire un conteggio manuale. Ho incluso questo nella cartella come un’opzione per la PTCP multianticoagulante, tuttavia, a causa della difficoltà di raccogliere un buon campione e della soggettività dei conteggi, insieme ai problemi associati ai calcoli necessari, i nostri patologi hanno deciso che non effettueremo la conta piastrinica manuale. Per questo motivo, sono attualmente coinvolto nel monitoraggio delle piastrine e condurrò un piccolo studio interno per confrontare le provette ACD, CTAD e Na Citrate in parallelo. A seconda dei risultati potremo anche testare l’amikacina. Se arriveremo a conclusioni illuminate scriverò un altro breve blog con i nostri risultati!
Grazie ancora ad Abu Jad Caesar, responsabile di laboratorio presso Medicare Laboratories – filiale di Tulkarm, in Palestina, che mi ha fornito questo caso perfetto da manuale di PCTP, che è stato facilmente risolto con la raccolta in Na Citrate. Vorremmo che tutti leggessero i libri di testo e fossero così collaborativi!
- CAPToday, January 2014. accessed online http://www.captodayonline/qa-column-0114
- ManthorpeR, Kofod B, et al. Pseudotrombocitopenia, In vitro studies on the underlyingmechanisms. Scand J Haematol 1981; 26:385-92
- NakashimaMO, Kottke-Marchant K. Platelet Testing: In: Kottke-Marhchant K, ed. AnAlgorithmic Approach to Hemostasis Testing, 2nd ed. CAP Press;2016:101
- Schuff-Werner,Peter, et al.Efficace stima della conta corretta delle piastrine nella pseudotrombocitopenia utilizzando un anticoagulante alternativo basato sul sale di magnesio. Brit J of Haematol Vol162, Issue 5. June 29, 2013
- Tan,Geok Chin et al. Pseudotrombocitopenia dovuta al clumping piastrinico: A Case Reportand Brief Review of the Literature. Case Reports in Hematology. Volume 2016
- Lixia Zhang, MMed,* Jian Xu, MD,* LiGao, MMed, Shiyang Pan, MD, PhD. Trombocitopenia spuria nel conteggio automatico delle piastrine. Medicina di laboratorio 49:2:130-133. 2018
- Zhou,Xiamian,et al. L’amikacina può essere aggiunta al sangue per ridurre la caduta della conta piastrinica. AmJournal of Clinical pathology, Vol 136, Issue 4, Oct 2011.
-Becky Socha, MS, MLS(ASCP)CM BB CM si è laureata al Merrimack College di N. Andover, Massachusetts con una laurea in tecnologia medica e ha completato il suo MS in scienze di laboratorio clinico all’Università del Massachusetts, Lowell. Ha lavorato come tecnologo medico per oltre 30 anni. Ha lavorato in tutte le aree del laboratorio clinico, ma ha un interesse speciale per l’ematologia e il blood banking. Quando non è impegnata a fare la scienziata pazza, la si può trovare fuori in bicicletta.