Campioni FFPE – Preparazione di campioni di tessuto umano – Lab-Ally

Tabella dei contenuti

Introduzione |Acquisizione del tessuto | Lavorazione del tessuto FFPE | Sezionamento | Riferimenti

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Introduzione

Molti ricercatori di oggi preferiscono usare campioni di tessuti FFPE per le loro analisi IHC, istologiche o genomiche in situ. FFPE sta per “Formalin-Fixed Paraffin-Embedded” e descrive le due caratteristiche chiave di questo metodo di conservazione dei tessuti. La formalina è una soluzione di formaldeide ed è stata utilizzata fin dalla scoperta alla fine del 1800 degli effetti conservanti della formaldeide da parte del medico tedesco Ferdinand Blum (Fox, et al., 1985). La paraffina viene infusa nel tessuto dopo la fissazione con la formaldeide, e il tessuto è anche circondato da un involucro di paraffina per aiutarlo a sostenere e proteggerlo dall’ossidazione. I campioni FFPE fissati e incorporati professionalmente e le biomolecole che contengono sono ragionevolmente stabili a temperatura ambiente. Strutturalmente, i tessuti fissati e incastrati sono resistenti e possono essere utilizzati per studi di anatomia microscopica quasi a tempo indeterminato, ma nel tempo, l’antigenicità di alcune proteine si degrada limitando gli studi IHC a campioni non più vecchi di qualche decennio. Il DNA a doppio filamento è sorprendentemente stabile nei blocchi FFPE, ma altre biomolecole meno stabili come l’RNA possono degradarsi entro un decennio o meno, specialmente una volta che le sezioni sono state tagliate.

Gli archivi che accumulano un gran numero di campioni FFPE sono una fonte particolarmente ricca di dati quando il confronto di molti casi (cioè campioni FFPE da più donatori) è desiderabile per trarre conclusioni statisticamente robuste sulle caratteristiche di particolari indicazioni. Se i campioni FFPE stanno per essere utilizzati nella ricerca biomedica “high stakes”, allora è importante che ogni fase del processo di preparazione sia eseguita da professionisti completamente addestrati e certificati, preferibilmente in un laboratorio certificato CLIA (cioè ispezionato dal governo) o accreditato CAP (College of American Pathologists).

Si noti che il processo FFPE non è universalmente standardizzato, e le istituzioni di tutto il mondo possono usare protocolli leggermente diversi con diverse soluzioni di formalina o altrimenti adattare il processo alle loro preferenze ed esigenze. Ciò che segue è una panoramica del processo e la descrizione di ciò che ogni fase comporta, così come alcune variazioni comuni.

Acquisizione del tessuto

Prima del trattamento del tessuto è la fase necessaria di acquisizione del tessuto. Questo è in realtà l’elemento più difficile da controllare perché si intreccia con la cura del paziente, la conformità al 41CFR46 e, negli Stati Uniti, la supervisione della commissione di revisione interna (IRB). Le specifiche della procedura medica e le convenzioni di cura standard sono importanti perché possono influenzare variabili come gli intervalli di tempo tra la somministrazione dell’anestesia e la legatura dei vasi, la rimozione del tessuto e il tempo trascorso prima della fissazione, ognuno dei quali può avere un impatto sulla qualità del campione. Per esempio, è probabile che si verifichino cambiamenti nell’RNA e nelle proteine durante l’intervallo di tempo, noto come tempo di ischemia calda, tra la legatura del sangue e la rimozione del tessuto (Dash, et al., 2002). Questo tempo di ischemia può variare da minuti a ore a seconda dell’organo, delle procedure operative standard dell’istituzione, del chirurgo e del personale sanitario coinvolto e dell’approccio chirurgico. Per questo motivo, è stato raccomandato di registrare questo tempo per ogni campione e di mantenerlo al minimo (Hewitt, et al., 2008).

L’elaborazione dei tessutiFFPE

Una volta che il campione di tessuto è stato acquisito, può essere necessario un ulteriore triage, dissezione o microdissezione (collettivamente indicato come grossing) per isolare e preparare la porzione specifica di tessuto che sarà passata attraverso le fasi di lavorazione rimanenti. La lavorazione dei tessuti oggi è spesso completamente automatizzata fino alla fase finale, l’inclusione, che può essere eseguita manualmente. Ci sono molti processori di tessuti disponibili, ma tutti seguono la sequenza delle prime quattro fasi mostrate sopra. L’automazione delle varie fasi aiuta ad eliminare le variazioni nella procedura come fonte di variazione dei risultati sperimentali tra diversi campioni FFPE.

Fissazione

La fissazione è la fase iniziale della lavorazione dei tessuti FFPE. I fattori critici da prendere in considerazione includono la soluzione da utilizzare, la durata della fissazione e lo spessore e le proprietà istologiche del campione di tessuto da fissare.

– Soluzione

Il fissativo che viene utilizzato dalla maggior parte dei laboratori è la formalina al 10% a tampone neutro. La formalina è un liquido che è 37-40% di formaldeide e 10% di metanolo (in peso) in acqua; così una soluzione di formalina al 10% contiene circa 3,7% – 4% di formaldeide e 1% di metanolo (Hewitt, et al., 2008; Kiernan, 2000). In realtà, la formaldeide esiste in soluzione principalmente come monomeri o piccoli polimeri di metilenglicole (metandiolo, formaldeide monoidrato) che si forma dalla reazione reversibile della formaldeide con l’acqua. I polimeri di metilenglicole ad alto peso sono chiamati paraformaldeide e precipiteranno fuori dalla soluzione, ma il metanolo rallenta questo processo di polimerizzazione che è la ragione della sua inclusione nelle soluzioni di formalina. La formalina diluita con acqua (come la formalina al 10%) – e specialmente se si tratta di una soluzione tampone – conterrà principalmente monomeri poiché il gran numero di molecole d’acqua rompe qualsiasi polimero di glicole metilenico che sarebbe normalmente esistito in una soluzione con una concentrazione di formaldeide più alta (Kiernan, 2000). I tamponi, il componente rimanente della formalina, vengono aggiunti anche perché la formaldeide ha la tendenza ad ossidarsi in acido formico (Fox, et al., 1985). L’acido formico nella fissazione dei tessuti può portare alla precipitazione dei granuli di pigmento della formalina (ematina acida) che possono assomigliare ai pigmenti prodotti da alcuni parassiti (Pizzolato, 1976). Il tamponamento della formalina impedisce che questo accada. Gli agenti tamponanti comuni includono carbonato di magnesio, carbonato di calcio, citrato, Tris, e tamponi di fosfato (Hewitt, et. al., 2008). La formalina commerciale spesso contiene tamponi di fosfato. “Neutral-buffered”, che è tipicamente il modo in cui la formalina viene preparata, significa semplicemente che il pH viene mantenuto a circa 7.

– Processo e meccanismo

A causa del basso peso molecolare della formaldeide e del glicole metilenico, la formalina (principalmente il glicole metilenico in soluzione) penetra nei tessuti relativamente velocemente, ad una velocità che dipende dal tipo di tessuto ma con una velocità media di 1mm/ora (Hewitt, et al., 2008). I protocolli per la fissazione variano quindi a seconda del tipo di tessuto da fissare. Una volta all’interno del tessuto, la frazione di molecole di formaldeide che sono presenti in soluzione inizierà a reticolare con le proteine, ma questo accade ad una velocità molto più lenta della velocità di diffusione. La reazione della formaldeide con il tessuto la tira fuori dalla soluzione e spinge la reazione reversibile formaldeide-metilenglicole indietro nella direzione della formaldeide, in modo che ne venga prodotta di più anche se viene consumata (Fox, et al., 1985). Le catene laterali amminiche della lisina sono le più reattive con la formaldeide, ma altre che sono in qualche modo reattive con la formaldeide includono arginina, asparagina, istidina, glutamina, serina e tirosina (Howat e Wilson, 2014). Dopo la reazione, il gruppo idrossimetilico risultante attaccato al complesso può poi reagire ulteriormente con la stessa proteina o con altre proteine, formando così stabili ponti metilenici (proteina-CH2-proteina) (Kiernan, 2000). È questo che produce l’insolubilità e la rigidità dei tessuti che sono stati fissati in formalina e quindi conservati. Sono necessarie circa 24-48 ore perché questa reticolazione si verifichi sufficientemente in tutto il tessuto (Thavarajah, et al., 2012), ma è stato raccomandato di non permettere più di 36 ore per questo processo, poiché la fissazione per un periodo di tempo più lungo ridurrà la qualità delle biomolecole nei campioni FFPE, ad esempio riducendo la lunghezza degli acidi nucleici che possono essere estratti (Hewitt, et al, 2008).

– Limiti

Il vantaggio principale dell’uso della formaldeide – specialmente come formalina al 10% a tampone neutro – è che conserva una vasta gamma di tessuti e componenti. Tuttavia, ha delle limitazioni. Per esempio, una combinazione di formaldeide con glutaraldeide (C5H8O2), o una soluzione di sola glutaraldeide, è tipicamente usata per la microscopia elettronica (Kiernan, 2000) poiché queste soluzioni sono migliori per preservare le strutture dei tessuti per questo scopo. Si noti che i tessuti preparati con una soluzione di glutaraldeide o glutaraldeide-aldeide non saranno considerati campioni FFPE. Un’altra sfida è il recupero delle molecole di DNA e RNA dai tessuti FFPE, poiché la formalina tende a modificare gli acidi nucleici – fino al punto di introdurre mutazioni artificiali nel DNA – e a romperli in piccoli frammenti (Srinivasan, Sedmak e Jewell, 2002). Tuttavia è possibile estrarre frammenti di DNA e RNA dal tessuto FFPE che sono adatti all’analisi, come descritto in un protocollo scritto da Tang, et al. (2009), con un fattore chiave nel recupero dell’acido nucleico che è la digestione appropriata della proteasi. Sono disponibili anche kit commerciali per l’estrazione di acido nucleico da campioni FFPE.

– Spessore del campione

Un altro punto importante da considerare riguardo alla fissazione in formalina è lo spessore del campione di tessuto. Mentre la formalina penetra nel tessuto in modo relativamente rapido, come menzionato sopra, lo spessore del tessuto influenzerà la qualità del campione fissato. Sarà necessario più tempo perché la formalina raggiunga il centro dei campioni di tessuto più spessi. Mentre la formalina si diffonde gradualmente nella parte più interna del campione, le regioni esterne avranno già iniziato il processo di fissazione, per cui è più probabile che le biomolecole si degradino nel tempo prolungato richiesto per la fissazione totale. Inoltre, se si rispettano i limiti di tempo (come un massimo di 36 ore come menzionato sopra), allora c’è la possibilità che il campione di tessuto non sia sufficientemente fissato (conservato) nella sua interezza. Per questo motivo, i tessuti per la fissazione che sono più grandi in larghezza di alcuni millimetri o forse uno o due centimetri sarebbero meglio sezionati in segmenti più sottili per una fissazione ottimale (Hewitt, et al., 2008). Le istituzioni possono avere diversi protocolli per la lunghezza del tempo e il volume di fissativo richiesto per i campioni di tessuto di diverse larghezze, ma in generale il rapporto tra il volume di fissativo e il volume del tessuto dovrebbe essere 10:1 (Klatt, 2016).

Deidratazione

La seconda fase del trattamento dei campioni FFPE è la disidratazione. Poiché la paraffina è immiscibile con l’acqua, tutta l’acqua della soluzione di formalina deve essere rimossa dal tessuto prima che la paraffina possa infiltrarsi in esso. Una serie di soluzioni di alcool (spesso etanolo), spesso iniziando con il 70% e progredendo fino all’alcool al 100%, sarà usata per rimuovere essenzialmente tutta l’acqua dal tessuto. Per una disidratazione ottimale è necessario usare soluzioni fresche o sostituire frequentemente le soluzioni usate, perché l’alcol si diluisce sempre di più con l’uso. È anche imperativo che questa fase sia completata completamente (con tempo sufficiente messo da parte per questa fase) perché una disidratazione insufficiente può portare alla degradazione del tessuto (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Clearing

Siccome la paraffina non è effettivamente miscibile negli alcoli, il passo successivo è quello di rimuovere l’alcool con una sostanza che è miscibile con la paraffina. Questo passo è noto come clearing, e lo xilene è l’agente di clearing più spesso usato (Klatt, 2016; Hewitt, et al., 2008).

Infiltrazione di paraffina

Dopo un’adeguata fissazione, disidratazione e clearing, il tessuto può finalmente essere sottoposto a infiltrazione (o impregnazione) di paraffina. Anche questa fase non è standardizzata, e le istituzioni di tutto il mondo possono usare diverse paraffine e miscele di cera di varia composizione. Le paraffine hanno punti di fusione e consistenze diverse che hanno un impatto sul blocco di tessuto finale e sulle sue caratteristiche. Negli Stati Uniti, così come nell’Europa occidentale, si usano normalmente paraffine sintetiche a basso punto di fusione (55°C-63°C) per ottenere i migliori risultati. Lattice, dimetilsolfossido e “plastificanti” proprietari possono essere inclusi nella formulazione per modificare la consistenza e la malleabilità del campione di tessuto finale (Hewitt, et al., 2008).

Le nazioni di altre parti del mondo spesso incorporano cera d’api nelle loro formulazioni per migliorare la malleabilità e diminuire la temperatura di fusione delle paraffine di bassa qualità utilizzate. La cera d’api contiene però dei contaminanti come il polline, e diminuisce la qualità del campione finale. Temperature di fusione più elevate sono da evitare perché in seguito risultano in una deparaffinizzazione ridotta e insufficiente del campione di tessuto e in una diminuzione della quantità di acidi nucleici recuperati dal tessuto (Hewitt, et al., 2008).

Integrazione in paraffina

L’ultimo passo nella lavorazione dei campioni FFPE è l’inclusione in paraffina. Il campione di tessuto infiltrato con paraffina è circondato da uno strato di paraffina. Bisogna fare attenzione a orientare correttamente il blocco di tessuto nello stampo (“cassetta”) perché questo ha un impatto sul piano di sezionamento quando le sezioni sottili vengono tagliate dal blocco con un microtomo (Klatt, 2016). Una volta che l’involucro di paraffina si è solidificato, il blocco FFPE è pronto per la conservazione e rimarrà ben conservato per anni, anche fino a decenni (Hewitt, et al., 2008).

Sectioning

Una volta che il tessuto è incorporato, è pronto per il sezionamento al microtomo. Poiché il tessuto non è sempre completamente piatto contro la parte anteriore della paraffina, l’istotecnologo deve tipicamente “affrontare” il blocco. Il blocco di tessuto viene messo nel portablocco del microtomo e, mentre si regola l’angolo del portablocco in modo da sprecare meno tessuto possibile, l’istotecnologo gira il volantino, muovendo il blocco su e giù contro una lama affilata. Il blocco viene tagliato fino a quando una sezione rappresentativa completa del tessuto si trova nella parte anteriore del blocco. Una volta che il tessuto è di fronte, il blocco viene messo su ghiaccio per raffreddarsi, il che aiuterà a facilitare il taglio di sezioni sottili; la paraffina troppo calda creerà un tessuto compresso con sezioni rugose. Quando il blocco è raffreddato, viene rimesso nel portablocco. Il tecnico gira di nuovo il volantino, questa volta ad un ritmo lento e regolare per creare sezioni sottili consecutive che si attaccano l’una all’altra, formando un “nastro”.” Il nastro viene posto su un bagno d’acqua calda (la temperatura viene mantenuta appena sotto il punto di fusione della paraffina) per appianare eventuali rughe che si sono formate. Il tecnico mette poi un vetrino da microscopio nel bagno d’acqua e “raccoglie” la sezione scelta in modo che si attacchi al vetrino.

Lo spessore più comune per le sezioni di tessuto è tra i 3-5 micrometri (o micron, in breve), che è lo spessore di una singola cellula. I vetrini con sezioni di 3-5 micron sono normalmente usati per la colorazione, che sia la colorazione standard Ematossilina & Eosina (H&E), la colorazione speciale o la colorazione immunoistochimica (IHC). I ricercatori spesso richiedono “riccioli” al posto delle sezioni sottili sui vetrini. I riccioli sono sezioni più spesse (10 micron o più) che vengono messe in provette Eppendorf e sono generalmente usate quando è necessario estrarre RNA o DNA dai campioni FFPE. Le sezioni spesse possono anche essere messe su vetrini invece che su provette; questo è ottimale quando solo una parte del tessuto sarà usata per l’estrazione. In questo caso, il tessuto viene raschiato dal vetrino e messo in una provetta. I campioni FFPE che sono stati sezionati sono strutturalmente stabili, e se trattati e conservati correttamente possono essere utilizzati per l’analisi microscopica per qualche tempo dopo che il sezionamento è avvenuto, ma se le estrazioni chimiche devono essere eseguite, allora generalmente le sezioni dovrebbero essere utilizzate il più presto possibile dopo il taglio per prevenire la degradazione ossidativa e biologica delle molecole bersaglio esposte.

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1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., & Roller, P. P. (1985). Fissazione della formaldeide. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 33(8), 845-853.
2. Dash, A., Maine, I. P., Varambally, S., Shen, R., Chinnaiyan, A. M., & Rubin, M. A. (2002). Cambiamenti nell’espressione genica differenziale a causa del tempo di ischemia calda dei campioni di prostatectomia radicale. The American Journal of Pathology, 161(5), 1743-1748.
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10. Klatt, E. C. Histotechniques: Elaborazione dei tessuti. Mercer University School of Medicine, Savannah. Recuperato da http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed Dec 28, 2016