Il 4 dicembre, ho visitato la Clinic for Special Children nel cuore della Pennsylvania Dutch country, dove un piccolo staff si occupa di oltre 2000 pazienti con una varietà di malattie ereditarie. Il post della settimana scorsa ha descritto una famiglia in cui 5 dei 6 bambini hanno un disturbo convulsivo che include caratteristiche autistiche. L’indagine su questa sindrome negli ultimi 15 anni illustra splendidamente l’evoluzione dei metodi di scoperta dei geni prima che il sequenziamento ci catapultasse in una nuova era tecnologica. (Attenzione: gergo in anticipo.)
CONNETTERE IL FENOTIPO AL GENOTIPO
Oggi, per identificare il gene dietro una condizione non diagnosticata in un bambino, i ricercatori confrontano le sequenze dell’esoma (parte di un genoma che codifica le proteine) dei genitori ed eventualmente dei fratelli per identificare le varianti genetiche causali (alleli). È veloce.
Nell’era pre-genoma, i ricercatori hanno seguito una traiettoria indiretta per arrivare dal fenotipo al genotipo:
– Notando che i sintomi “corrono nelle famiglie.”
– Trovando la condizione di essere più comune tra i gemelli identici rispetto ai gemelli fraterni, e tra i fratelli di pazienti che nella popolazione generale.
– Identificando cromosomi anomali in persone con la condizione.
– Utilizzando studi di associazione genome-wide (GWAS) per identificare i modelli di variazione genetica (in serie di siti a base singola chiamati polimorfismi a singolo nucleotide, o SNPs) che potrebbero segnalare una variante che causa la malattia.
– Identificando il gene e facendo un modello di topo per testare i trattamenti.
Quando gli Amish lasciarono la Svizzera all’inizio del 1700 per sfuggire alla persecuzione religiosa e si stabilirono in Pennsylvania, hanno portato un campione del pool genetico europeo. Riprodursi tra di loro ha amplificato le mutazioni e ha portato a “corse di autozigosi” nei loro genomi – sezioni di cromosomi che hanno le stesse sequenze di DNA su entrambe le copie. I percorsi di autozigosi indicano che due parenti hanno ereditato serie di varianti genetiche da un antenato condiviso, come i cugini di secondo grado da un bisnonno. Questi alleli, soprannominati “identici per discendenza” (IDB), sono un potente strumento per la scoperta di geni se si presentano esclusivamente in persone che hanno la stessa malattia.
LA CONNESSIONE AMISH
Il ragazzo che ho incontrato alla clinica e 4 dei suoi 5 fratelli hanno la sindrome da displasia corticale-epilessia focale (CDFE). Nasce da una singola base mancante del DNA in un gene chiamato CNTNAP2.
Come molte storie di scoperta di geni, la scoperta che le mutazioni in CNTNAP2 sono alla base di una varietà di condizioni del cervello – autismo, convulsioni, schizofrenia, sindrome di Tourette e disturbi del linguaggio – è iniziata con fili diversi. Concentriamoci sulla connessione dell’autismo.
Anche le tecniche genetiche più antiche dimostrano una componente ereditaria dell’autismo. I gemelli identici hanno molte più probabilità di averlo entrambi rispetto ai gemelli fraterni; i fratelli di un bambino con autismo hanno un rischio 75 volte superiore a quello della popolazione generale.
Nel 1998, l’International Molecular Genetic Study of Autism Consortium ha usato il GWAS per identificare 6 regioni nel genoma che sono state tracciate con persone che hanno l’autismo – il principale contendente era sul braccio lungo del settimo cromosoma più grande, o “7q.”
Nel 1999, i ricercatori hanno implicato CASPR2, un tipo di proteina chiamata neurexina che, quando anormale, interrompe l’invio di un impulso nervoso. Le neurexine si allineano con altre proteine chiamate neuroligine per creare le sinapsi che si formano quando un bambino piccolo comincia ad esplorare il mondo, consolidando la memoria in apprendimento.
Nel 2003 sono arrivati rapporti di cromosomi riarrangiati che interrompono il gene che codifica CASPR2, CNTNAP2, in persone con la sindrome di Tourette e nel 2007 con persone che hanno disabilità intellettuale, ritardo dello sviluppo, difficoltà di parola e iperattività, ma non la Tourette. Queste diverse condizioni non sono sorprendenti – gli effetti variano a seconda di dove nel cervello i livelli di neurexina sono squilibrati.
Nel 2006, i ricercatori della Clinic For Special Children e il Translational Genomics Research Institute hanno abbinato una mutazione in CNTNAP2 alla sindrome CDFE in bambini Amish strettamente correlati. Le crisi iniziano all’incirca all’età in cui le caratteristiche autistiche tendono ad emergere – dai 14 ai 20 mesi.
Prima che le crisi inizino, i sintomi della CDFE sono sottili: piccoli ritardi motori, scarsi riflessi tendinei profondi e teste leggermente grandi. I bambini hanno difficoltà a concentrarsi, a imitare le persone e a pianificare i movimenti, come strisciare, girare e camminare. Le crisi sono frequenti e gravi, e il loro inizio preannuncia il declino delle abilità – linguistiche, cognitive e sociali. Dopo diversi anni le crisi cessano, ma l’intelletto rimane fermo nell’infanzia e l’individuo richiede cure per tutta la vita.
Kevin Strauss, MD, Erik Puffenberger, PhD, e Holmes Morton, MD, della Clinica e i loro colleghi hanno utilizzato 100.000-SNP microarray per analizzare il DNA di quattro bambini con sindrome CDFE da tre famiglie Amish. Hanno trovato una regione autozigote lunga 7,1 milioni di basi sull’area sospetta sulla 7q. (Oggi gli algoritmi individuano rapidamente l’autozigosi nelle sequenze dell’esoma.)
I 7,1 milioni di basi includono 83 geni, ma solo alcuni avevano senso. Il team ha prima sequenziato un gene chiamato CENTG3 noto per causare altri disturbi cerebrali. Ma i bambini malati non avevano mutazioni in esso.
Poi il dottor Puffenberger, il genetista del team, ha trovato una scorciatoia: ha notato uno SNP nel mezzo di CENTG3 che era eterozigote in due bambini (due varianti diverse), piuttosto che omozigote (la stessa variante in entrambe le copie del cromosoma), segnando una fine alla regione identica per discendenza. “Un evento di ricombinazione nel mezzo del gene ha permesso a Eric di sbarazzarsi di gran parte di esso per trovare la mutazione. È un perfetto esempio di ‘il caso favorisce la mente preparata’”, mi ha detto il dottor Morton. Quella scoperta ha ridotto la regione di interesse su 7q a 3,8 milioni di basi.
Il secondo gene candidato, CNTNAP2, è a cavallo della regione di interesse. Ad ogni bambino mancava una singola base da entrambe le copie del cromosoma 7 lì, e ogni genitore aveva la stessa mutazione, ma in una sola copia. Sono portatori. Era la prima legge di Mendel al lavoro.
Il team aveva trovato il loro gene. Hanno poi cercato ulteriormente nella comunità, e tra 105 persone Amish sane, quattro erano portatori. Nove dei 18 pazienti che avevano crisi parziali ma nessuna diagnosi specifica, da 7 famiglie, avevano la sindrome CDFE.
Le crisi erano sconcertanti. “Una mutazione può causare diversi tipi di crisi. Quattro bambini in una famiglia rispondono in modo diverso. Alcuni sono molto disabili, altri non molto colpiti”, ha detto il dottor Morton. Tre bambini sono stati operati per alleviare le convulsioni, ma il sollievo non è durato. Tuttavia, gli interventi chirurgici hanno fornito campioni di tessuto cerebrale che hanno permesso ai ricercatori di descrivere meglio ciò che stava andando male.
La connettività nei cervelli soggetti a crisi è un casino. I confini della materia grigia e della materia bianca si confondono e alcune parti della corteccia cerebrale sono ispessite. I neuroni stessi non sono del tutto a posto. Sono troppo rotondi, troppo compatti, con alberi dendritici squilibrati. I puntini sui neuroni indicano troppi nuclei di glia, le cellule di supporto che compongono la maggior parte del sistema nervoso. Il rapporto di ricerca del 2006 è stato poetico, descrivendo l’amigdala, la sede delle emozioni, nei cervelli epilettici come “isole microscopiche eccentriche di precursori neuronali parzialmente maturati in grappoli stretti” avvolti dalla glia impazzita.
Il ritratto del cervello epilettico Amish aveva senso alla luce del lavoro sulla proteina neurexina CASPR2 (che sta per contactin-associated protein-like 2). La neurexina forma un’impalcatura ai nodi di Ranvier. I nodi sono i siti esposti su un assone tra i cuscini di mielina, il materiale isolante che è in realtà le membrane cellulari della glia avvolte intorno al neurone come un cerotto intorno a un dito. Gli impulsi nervosi attraversano i nodi, inviando messaggi abbastanza veloci da sostenere la vita.
Le proteine CASPR2 nei bambini Amish sono stentate. Non attraversano le membrane cellulari dei neuroni e non si immergono nel citoplasma come dovrebbero, e di conseguenza i canali di potassio vicini collassano. Questi canali normalmente permettono agli ioni di potassio di precipitarsi fuori dalle cellule nervose al passaggio di un impulso, resettandolo. Così, senza l’impalcatura di neurexina, il neurone non può resettarsi. La trasmissione si ferma. E, in qualche modo, iniziano le convulsioni. Non credo che si sappia se le convulsioni inducono le caratteristiche autistiche o sorgono direttamente – ulteriori studi genetici dovrebbero indicarlo.
UN MODELLO DI MOUSE
Daniel Geschwind, MD, PhD e professore di neurologia presso la David Geffen School of Medicine alla UCLA, stava lavorando sui geni dell’autismo, e ha letto il documento del 2006 nel New England Journal of Medicine. “Ha chiamato e ha detto, ‘hai trovato il mio gene! Una bella collaborazione è iniziata, e ha fatto un topo con la mutazione Amish”, ha detto il dottor Morton. I topi hanno il gene CNTNAP2 eliminato, e come le persone, hanno convulsioni e caratteristiche autistiche.
“Un topo di solito corre la gabbia intorno, normalmente sociale e chiacchierone. Questi topi non erano nessuno dei due”, ha spiegato il dottor Morton. I topi mostravano anche comportamenti ripetitivi e avevano convulsioni.
Il cervello dei topi mutanti ha mostrato un modello di connettività anormale che ricorda il precedente lavoro istologico. “La parte anteriore del cervello parla principalmente con se stessa. Non comunica molto con altre parti del cervello e manca di connessioni a lungo raggio con la parte posteriore del cervello”, ha detto il dottor Geschwind. Il gruppo aveva mostrato anomalie simili nel cervello dei bambini con autismo.
La sorprendente somiglianza tra i bambini Amish e i topi fornisce un terreno di prova per i farmaci. Il Risperidone, prescritto per trattare i comportamenti ripetitivi nei bambini, ha avuto lo stesso effetto sui topi, migliorando anche la loro capacità di costruire nidi. Ma il farmaco non aiuta i bambini a socializzare.
Un ovvio farmaco candidato per migliorare le abilità sociali è l'”ormone dell’amore” ossitocina. È abbondante negli stessi neuroni del cervello che sono ricchi di proteina CASPR2. Potrebbe l’ossitocina troppo poco causare caratteristiche autistiche? I risultati dell’integrazione dell’ossitocina sono promettenti, sia nei topi che nei bambini.
Il dottor Geschwind e collaboratori hanno scoperto che uno spray nasale di ossitocina “migliora drammaticamente i deficit sociali” nei topi. Poiché i topi non autistici non hanno risposto, l’ormone sembra effettivamente compensare un deficit.
Gli agricoltori amish danno già l’ossitocina alle mucche per contrarre i loro muscoli uterini, e ricordo di averla presa per accelerare un travaglio in stallo. Ma non provate a farlo a casa. Diversi studi clinici sono in corso per l’ossitocina o farmaci che aumentano la sua attività nel cervello per migliorare la socializzazione nei bambini con autismo.
Autism Speaks ha finanziato il primo studio clinico di ossitocina nel 2010, e NIH sta sponsorizzando una prova più grande in corso di ossitocina spray nasale. Ma per quanto posso dire, i pazienti sono stati arruolati in base alle diagnosi cliniche secondo il DSM-IV – non il criterio più specifico del genotipo.
Anche se l’idea di provare l’ossitocina per migliorare i sintomi sociali nell’autismo non richiedeva di conoscere la mutazione sottostante, tali informazioni possono aggiungere precisione a qualsiasi conclusione considerando il meccanismo – che può portare a sviluppare altri trattamenti. In un altro post guarderò come la precisione genetica ha permesso al Dr. Morton di sviluppare cure per alcuni errori congeniti del metabolismo che sono molto più comuni tra gli Amish, ma ancora si presentano sugli schermi dei neonati di tutti.