The function of chaperone proteins in the assemblage of protein complexes involved in gamete adhesion and fusion processes

Multiprotein complexes in sperm capacitation and ZP interaction

A megtermékenyülés helyére, az ampullába érve a spermiumoknak két akadályon kell áthatolniuk, mielőtt összeolvadnak a petesejt plazmamembránjával, az oolemmával. Az első ezek közül az oocitát körülvevő cumulus sejtek hialuronsavban gazdag rétege, a második pedig maga az oocita extracelluláris mátrixa, a ZP (Hartmann et al. 1972). Annak ellenére, hogy a spermatogenezis során mind a ZP, mind a hialuronsav kötőhelyek kialakulnak, és a kötődési potenciál megszerzése a spermiumok mellékheréden való áthaladása során megtörténik, ezeknek a sejteknek a női reproduktív traktusban való tartózkodási időre van szükségük ahhoz, hogy sikeresen részt tudjanak venni az ilyen kölcsönhatásokban (Austin 1951, Chang 1951). A spermiumok által ebben a környezetben végbemenő kollektív változások, amelyeket kapacitációnak nevezünk, lehetővé teszik a sejtek számára, hogy reagáljanak a cumulus oocyta komplexből származó jelekre, és befejezzék az akroszomális exocitózis folyamatát, ami alkalmassá teszi őket az oolemmával való fúzióra.

A ZP egy sor szulfoglikoproteinből áll, nevezetesen a ZP1, ZP2 és ZP3, amelyek a legtöbb emlősfajban erősen konzerváltak (bár egy további ligandumot, a ZP4/B-t, emberi és sertés oocitákban jelentették) (Wassarman et al. 1999, Lefievre et al. 2002, Yonezawa et al. 2012). Általánosan elfogadott nézet, hogy a legtöbb fajban ezek a ligandumok irányítják a spermiumok kötődését (lásd még Reid és mtsai. (2011)). Figyelemre méltó azonban, hogy jelenleg még mindig különböző modellek vannak érvényben a ZP-n belüli elsődleges spermareceptor azonosságát és a spermiumok e mátrixhoz való tapadásának mechanizmusait illetően (lásd még Visconti & Florman (2010)). Hasonlóképpen, a ZP megfelelő ligand(oka)t felismerő, megfelelő spermiumfelszíni receptor(ok) azonosságára vonatkozó vizsgálatok sem adtak végleges választ. Valójában egyre nagyobb irodalma van az ígéretes receptorfehérje-jelöltek (köztük a β-1,4-galaktozil-transzferáz (GALT1), az arilszulfatáz A (ARSA) és a spermium adhéziós molekula 1 (SPAM1); a teljes listát lásd Ikawa és mtsai. (2010)) egérkoppintásoknak, amelyek mindegyike nem eredményez teljes meddőséget (Hess és mtsai. 1996, Asano és mtsai. 1997, Baba és mtsai. 2002). Inkább a csökkent kötődési képesség különböző fokozatait mutatják, ami felveti annak lehetőségét, hogy ez a folyamat bizonyos fokú funkcionális redundanciát foglal magában, és hogy számos spermiumfehérje együttesen közvetíti a ZP adhéziót. E fehérjék aktivitásának koordinálása a produktív ZP kölcsönhatások biztosítása érdekében így fontos kutatási területnek tűnik.

A legtöbb eutheri emlősben a spermiumok kapacitációja feltehetően egy cAMP-mediált útvonal aktiválásával indul, amely több spermiumfehérje tirozin-foszforilációjában csúcsosodik ki (Visconti et al. 1995a, 1995b, Leclerc et al. 1996). A molekuláris chaperonok kiemelkedő szerepet játszanak e fehérjék között, a HSP90AA1, a HSP90B1 és a HSPD1 azon fehérjék közé tartoznak, amelyekről kiderült, hogy a kapacitáció következtében tirozin-foszforilációt mutatnak (Ecroyd és mtsai. 2003, Asquith és mtsai. 2004). A jelenlegi modellek szerint e chaperonok foszforilációja a kapacitáció során kiváltja aktív szerepüket a ZP-felismerő fehérjék komplexekbe történő összeszerelésében és/vagy e komplexek transzlokációját a spermiumok felszínére a megtermékenyítés előkészítése során (Ecroyd et al. 2003, Asquith et al. 2004, Nixon et al. 2005, Gadella 2008). Az ivarsejtek adhéziójában betöltött ezen közvetett szerepükön túlmenően a spermiumfelszíni chaperonok állítólag olyan adhéziós molekulaként is működnek, amelyek közvetítik a szulfoglikolipidek felismerését az ivarsejtek kötődése során (Boulanger és mtsai. 1995, Mamelak & Lingwood 2001).

A közelmúltban a kék natív PAGE (BN-PAGE) technikát, amelyet eredetileg az elektrontranszportlánc multienzimkomplexeinek elemzésére fejlesztettek ki (Schägger & von Jagow 1991, Schägger et al. 1994), egerek és emberek multimer spermiumfelszíni komplexeinek vizsgálatára adaptálták (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Ez a technika lehetővé teszi a biológiai aktivitásukat megőrző natív fehérjekomplexek elektroforetikus felbontását. Emberi és egér spermiumokban a BN-PAGE és a Far-Western blotting párhuzamos alkalmazása teljes szolubilizált zónákkal számos olyan elsődleges multifehérje-komplexet mutatott ki, amelyek affinitással rendelkeznek a homológ ZP-hez (Dun és mtsai. 2011, Redgrove és mtsai. 2011).

Az egyik ilyen komplexről azt jelentették, hogy a CCT/TRiC komplex (CCT1-CCT8) fehérjekomponenseiből áll, amely egy kettős gyűrűs szerkezet, amely molekuláris chaperonként működik, és kulcsszerepet játszik a multiprotein komplexek kialakulásának szabályozásában (Feldman et al. 1999, Guenther et al. 2002). A koimmunoprecipitációs, ko-lokalizációs és proximity ligációs vizsgálatokkal nyert feltételezett bizonyítékok a ZP binding protein 2-t (ZPBP2) a CCT/TRiC-komplex egyik legmeggyőzőbb kliensfehérjeként azonosították az érett spermiumokban (Dun et al. 2011, Redgrove et al. 2011). Eredetileg a másodlagos ZP-kötésben játszott szerepet, egy újabb vizsgálat azonban kimutatta, hogy a ZPBP2 szempontjából nulla hím egerek szubfertilek, és hibákat mutatnak a ZP kölcsönhatásban és a behatolásban (Lin et al. 2007). Egerekben további bizonyíték van arra, hogy bizonyos CCT/TRiC komplex alegységek transzlokálódnak a spermiumok felszínére a spermiumok kapacitációja során (Dun et al. 2011).

A chaperonok másik kiemelkedő osztálya, amelyet a spermiumok felszínén azonosítottak és a ZP kölcsönhatások szabályozásában szerepet játszik, a HSP70 család (Naaby-Hansen et al. 2010). A CCT/TRiC-komplexhez hasonlóan a HSP70 család chaperonjai is jól dokumentált szerepet játszanak mind a transzmembránfehérje-transzport, mind a stabil fehérjekomplexek összeszerelésének elősegítésében (Mayer & Bukau 2005). Úgy tűnik, hogy a HSP70 család egyik tagja, amely kizárólag (egér) vagy túlnyomórészt (ember) a herékben fejeződik ki, nélkülözhetetlen a hím termékenységhez. Ennek a chaperonnak, a HSPA2-nek az aberráns expresszióját valóban összefüggésbe hozták a súlyos hímivarsejtes meddőség fenotípusával emberben, amely kifejezetten befolyásolja a spermiumok azon képességét, hogy in vitro kölcsönhatásba lépjenek a homológ petesejtekkel (Eddy 1999, Huszar et al. 2007). Egerekben és emberekben egyaránt alapvető szerepe van a HSPA2-nek a spermatogenezisben, a fehérje célzott deléciója az előbbi fajban e folyamat korai leállásához és ezzel együtt a spermiumok hiányához vezet (Eddy 1999). Emberekben a HSPA2 expressziós szintje pozitívan korrelált az in vitro megtermékenyítés sikerével (Huszar et al. 2000, 2006, Cayli et al. 2003), és így állítólag nagy pontossággal képes megjósolni a férfiak termékenységi állapotát (Ergur et al. 2002).

A HSPA2 saját laboratóriumunkban végzett jellemzése kimutatta, hogy ez a chaperon jelen van a humán spermiumok akroszomális doménjében, és legalább öt nagy molekulatömegű fehérjekomplex összetevője (Redgrove és mtsai. 2012), beleértve a korábban kimutatott ZP-affinitással rendelkező fehérjék egy alcsoportját (Redgrove és mtsai. 2011). Ezekkel az adatokkal összhangban bizonyítékot szereztünk arra, hogy a legdominánsabb HSPA2-komplex két további fehérjét tartalmaz, amelyek mindegyike korábban már szerepet játszott a spermium-zóna kölcsönhatásokban (Redgrove és mtsai. 2012). Továbbá, egyetértésben Huszar és munkatársai publikált eredményeivel, sikerült kimutatnunk, hogy az izolált elváltozásokkal rendelkező férfiak spermiumaiban a HSPA2 szintje jelentősen csökkenti a homológ petesejtek ZP-jével való in vitro interakcióra való képességüket (Redgrove és munkatársai 2012). Jelenlegi munkánk arra összpontosít, hogy a ZP-adhézió deficitje vagy a ZP-kötőhelyek aberráns kialakulásából ered a spermiogenezis korai szakaszában (Huszar és mtsai. 2000), vagy pedig annak a következménye lehet, hogy a HSPA2 nem képes részt venni a spermiumok felszíni remodelling eseményeiben a kapacitáció során, mint például a ZP-receptorok összeszerelésének és/vagy bemutatásának elősegítése a spermium felszínén a ZP-interakció előkészítéseként.

A spermiumfelszíni komplexek összeszerelésével kapcsolatos saját munkánk mellett Han és munkatársai egymástól függetlenül azonosítottak egy alternatív, chaperonokkal terhelt multiprotein komplexet egér spermiumok felszínén. Érdekes módon, amint azt fentebb dokumentáltuk, ez a HSPA5-öt, calnexint, 2B integrál membránfehérjét és ADAM7-et tartalmazó komplex nyilvánvalóan a kapacitáció során áll össze (Han et al. 2011). Bár e komplex funkcióját még nem sikerült teljesen tisztázni, az ADAM7 expresszióját további ADAM fehérjék, az ADAM2 és ADAM3 jelenlétéhez kapcsolták (Kim et al. 2006), amelyek fontosak a spermiumok ZP-hez való tapadásában (Muro & Okabe 2011). Ezenkívül ismert, hogy a HSPA5 részt vesz a kiváló minőségű spermiumok oviductalis epithelsejtekhez (OEC) való tapadásának elősegítésében a női reproduktív traktus isthmusában. E rezervoár kialakulásának feltehetően túlélést elősegítő hatása van a spermiumok nem-kapacitált, nyugalmi állapotban tartása szempontjából, előkészítve a petesejtnek az ampullába történő felszabadulását (Topfer-Petersen és mtsai. 2002). Érdekes módon a HSPD1 és HSPA5 chaperonokat is lokalizálták a szarvasmarha OEC felszínén, és így szerepet játszanak a spermium-OEC kötődésben (Boilard et al. 2004).

A saját munkánkkal is összhangban van a Han et al. által azonosított komplex. kimutatták, hogy membrán mikrodomainekben vagy lipid raftokban található, a membrán speciális régióiban, amelyek platformot biztosítanak a multiprotein komplexek funkcionális összeállításához és bemutatásához (Stein és mtsai. 2006, Nixon és mtsai. 2009, Han és mtsai. 2011). A chaperon-komplexek raft-környezetbe történő partícionálódását a HSPA2 esetében emberi spermiumokban (Nixon et al. 2011) és a CCT/TRiC-komplex komponensei esetében egérspermiumokban (Dun et al. 2011) is megfigyelték. Ezek a membrándomének számos további feltételezett ZP-receptor fehérjét is tartalmaznak, köztük a GALT1, a ZP3R és a SPAM1, ami megerősíti szerepüket a spermiumfelszín átalakításában és a ZP-kötésben (1. ábra; Nixon et al. 2009, Asano et al. 2010). Még nem tisztázott, hogy milyen mechanizmus(ok) révén rekrutálódnak ezek a fehérjék a lipid raftokba; azonban a HSPA2-ről azt jelentették, hogy ATPáz doménjén keresztül kötődik a 3′-szulfogalaktozil-glicerolipidhez, a spermiumok lipid raftjain belül azonosított fő glikoproteinhez (Mamelak & Lingwood 2001).

A lipid raftok kulcsfontosságú chaperon-komplexek és ZP-receptor fehérjék újrapozícionálásában játszott feltételezett szerepe mellett meggyőző bizonyíték van arra is, hogy számos feltételezett ZP-receptor, például az ARSA és a ZP3R, valamint számos molekuláris chaperon kapacitációtól függő áthelyeződést mutatnak az intracelluláris helyekről, például az akroszómából a spermium felszínére, hogy a sejteket a ZP-vel való kölcsönhatásuk előtt előkészítsék (Nixon és mtsai. 2009). Azt javasolták, hogy a külső akroszóma membrán és a spermium plazmamembránja közötti bensőséges kapcsolat a komplementer oldható N-etilmaleimid-érzékeny faktor csatolási fehérje receptor (SNARE) fehérjék kötődése révén jön létre, ami fúziós pórusok kialakulásához vezet, amelyek utat biztosítanak az enzimek vándorlásához a spermium felszínére az akroszóma tartalmának teljes elvesztése előtt (Søgaard és mtsai. 1994, Blas és mtsai. 2005, Tsai és mtsai. 2007). E modell alátámasztására Brahmaraju és munkatársai (2004) tanulmánya kimutatta, hogy a VAMP és SNAP elleni antitestek beadása az akroszomális vezikulába gátolta a spermium-ZP kötődést egérben.

A spermium felszínének ez a fokozatos alapozása kérdéseket vetett fel az akroszomális exocitózis mindent vagy semmit jellegével kapcsolatban. Mindazonáltal úgy tűnik, hogy a SNARE-komplexek funkcionális összeszerelése is alátámasztja az elhúzódó spermiummembrán-fúziós eseményeket, amelyek lehetővé teszik az akroszóma tartalmának teljes elvesztését (Tsai és mtsai. 2010). Bár széles körben elterjedt nézet, hogy a legtöbb emlősfajban a ZP-vel való érintkezés indítja el ezt az akroszomális exocitózist, számos egéren végzett vizsgálat kimutatta, hogy a ZP-vel való érintkezés előtt akroszomális exocitózist megkezdő spermiumok még képesek megtermékenyíteni a petesejtet (Nakanishi és mtsai. 1999, Jin és mtsai. 2011). Ez a jelenség a tengerimalac (Huang et al. 1981) és a hörcsög spermiumokra is igaz lehet (Yanagimachi & Phillips 1984). Ezek az eredmények a cumulus oophorus fontos szerepére utalnak az akroszómareakció beindításában, és aggályokat vetnek fel azzal kapcsolatban, hogy a cumulus-enyhített oocita zónaszerkezetekkel végzett in vitro vizsgálatok képesek-e pontosan beszámolni az akroszómareakció és valóban a ZP kölcsönhatás valódi természetéről.

Az ilyen ellentmondások ellenére a chaperon-szerű molekulákat az akroszomális exocitózisban is kapcsolatba hozták azzal, hogy képesek elősegíteni a glutamin-tartalmú SNARE-k (Q-SNARE-k) és az arginin-tartalmú SNARE-k (T-SNARE-k) szoros terner komplexekbe való összeállását (Tomes et al. 2002, Sørensen 2005). Érdekes módon sertéseken végzett elegáns vizsgálatok kimutatták, hogy a megtermékenyítés előkészítéseként a kapacitáció a spermium plazmamembránjának stabil dokkolását indukálja a külső akroszómális membránhoz (Tsai és mtsai. 2010). A Tsai és munkatársai (2012) által végzett újabb vizsgálatok szintén bizonyítékot szolgáltattak az unilamelláris vegyes vezikulák jelenlétére, amelyek más fontos funkciók mellett lehetővé teszik a másodlagos ZP-kötő fehérjék toborzását a spermium felszínén, és egy új trimer SNARE-komplexszel rendelkeznek, amely szintaxin 3-ból, SNAP23-ból, VAMP2-ből és egy további fehérjéből, a komplexin 2-ből áll. Az ilyen komplexek kialakulásával felszabaduló energiát viszont a spermium plazmamembránjának és belső akroszomális membránjának összehúzásával a membránfúzió megindítására használják fel (Tomes és mtsai. 2002). Ennek a folyamatnak a befejezése kritikus fontosságú a spermiumok azon domének expozíciója szempontjából, amelyek részt vesznek a megtermékenyítés downstream eseményeiben: az oolemma megkötésében és a fúzióban.